Детальные исследования стадий малярийных паразитов комаров имеют решающее значение для разработки эффективных стратегий блокирования передачи. Этот протокол демонстрирует, как эффективно культивировать инфекционные гаметоциты, а затем скармливать эти гаметоциты комарам для генерации стадий комаров P. falciparum.
Малярия остается одной из наиболее важных проблем общественного здравоохранения, вызывающей значительную заболеваемость и смертность. Малярия является заболеванием, передаваемым комарами, передаваемым через инфекционный укус от самки комара Anopheles. Борьба с малярией в конечном итоге будет опираться на множество подходов, которые включают способы блокирования передачи комарам, через них и от них. Для изучения стадий малярийных паразитов комаров в лаборатории мы оптимизировали протокол культивирования высокоинфекционных гаметоцитов Plasmodium falciparum, стадии паразита, необходимой для передачи от человека-хозяина комару-переносчику. Гаметоциты P. falciparum созревают через пять морфологически различных этапов, что занимает примерно 1-2 недели. Культура гаметоцитов, описанная в этом протоколе, завершается за 15 дней и заразна для комаров с 15-18 дней. Эти протоколы были разработаны для поддержания непрерывного цикла заражения компетентными гаметоцитами и для поддержания бесперебойного снабжения комаров стадиями паразита. Здесь мы описываем методологию культивированию гаметоцитов и то, как заразить комаров этими паразитами с помощью стеклянных мембранных кормушек.
Малярия вызывается паразитами Plasmodium и передается их позвоночным хозяевам через инфекционный укус самок комаров Anopheles. Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) за 2019 год, было зарегистрировано 405 000 смертей из 228 миллионов случаевмалярии1. Большинство случаев смерти от малярии было сосредоточено в африканском регионе, особенно среди детей в возрасте до пяти лет. В то время как общий уровень заболеваемости малярией снизился во всем мире с 2010 года, в последние годы спад стабилизировался, и для ликвидации этого заболевания срочно необходимы дополнительные стратегии борьбы.
Циклические стадии бесполой крови малярийных паразитов вызывают патогенез заболевания, и небольшое подмножество из них дифференцируется на женские и мужские гаметоциты. Гаметоциты Plasmodium falciparum уникальны по своей природе, так как им занимает 7-10 дней для развития через пять морфологически различных стадий. Незрелые гаметоциты от I до IV стадии секвестрируются в паренхиме костного мозга и в значительной степени остаются отсутствующими в периферическом кровообращении2,3,4,5. Эритроциты, инфицированные зрелыми гаметоцитами V стадии, высвобождаются в кровотоке и свободно циркулируют, чтобы быть захваченными комарами. Попав внутрь москитовой средней кишки, гаметоциты активируются, посредством изменения температуры и воздействия среды средней кишки, трансформируются в женские и мужские гаметы и начинают развитие стадий комара, которое завершается инфекционными стадиями спорозоитов в слюнных железах комара6,7.
С тех пор, как Трагер и Дженсон8 описали стандартизированный метод культивирования P. falciparum,исследования стадий беспологий крови значительно продвинулись. Однако отсутствие надежной системы культивовки половых стадий затруднило изучение гаметоцитов P. falciparum, биологии передачи и стадий комаров. В последние годы было опубликовано несколько методов, которые помогли лабораториям в создании культур гаметоцитов9,10,11,12. Эта рукопись описывает стандартизированный и надежный протокол к культуре гаметоцитов P. falciparum, который может представлять собой ценный ресурс для сообщества исследователей малярии. Этот метод обеспечивает надежную выработку зрелых и инфекционных гаметоцитов, что наряду со стандартизированным протоколом кормления комаров приводит к высоконадежной инфекционности комаров. Эти методы были установлены для поддержания бесперебойного снабжения гаметоцитами и паразитами стадии комаров. В этой рукописи мы описываем тщательный протокол посева гаметоцитов(Рисунок 1),приготовление кормушек со стеклянной мембраной и заражение комаров с помощью этих мембранных кормушек(Рисунок 2),рассечение средней кишки(Рисунок 3)и слюнных желез комаров(Рисунок 4),а также количественную оценку инфекции у комаров после рассечения средней кишки и слюнных желез.
Методы, описанные здесь, успешно используются в Научно-исследовательском институте малярии Джона Хопкинса более 10 лет15,16,17,18,19,20,21,22. Гаметоц…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Bloomberg Philanthropies за финансовую поддержку Научно-исследовательского института малярии Джона Хопкинса (JHMRI). Эта работа была бы невозможна без экспертных знаний, предоставленных основными учреждениями JHMRI по насекомым и паразитологии.
10% Sugar solution | |||
10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
37°C Incubator | |||
50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
70% Ethanol | |||
9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
cell counter | |||
Circulating water bath | |||
fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
Glass desiccator | |||
Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
HBSS | Sigma | H6648 | |
Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
Micro Pipette | |||
Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
Mosquito cups | Neptune cups | ||
N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
Parafilm | |||
PBS | |||
Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
Pipet tips | |||
Pipetman | |||
Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
Slide warmer | |||
Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
water bath | |||
Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |