Плазмодий фальципарум Культура гаметоцитов и инфекция комаров через искусственное мембранное питание

Summary

Детальные исследования стадий малярийных паразитов комаров имеют решающее значение для разработки эффективных стратегий блокирования передачи. Этот протокол демонстрирует, как эффективно культивировать инфекционные гаметоциты, а затем скармливать эти гаметоциты комарам для генерации стадий комаров P. falciparum.

Abstract

Малярия остается одной из наиболее важных проблем общественного здравоохранения, вызывающей значительную заболеваемость и смертность. Малярия является заболеванием, передаваемым комарами, передаваемым через инфекционный укус от самки комара Anopheles. Борьба с малярией в конечном итоге будет опираться на множество подходов, которые включают способы блокирования передачи комарам, через них и от них. Для изучения стадий малярийных паразитов комаров в лаборатории мы оптимизировали протокол культивирования высокоинфекционных гаметоцитов Plasmodium falciparum, стадии паразита, необходимой для передачи от человека-хозяина комару-переносчику. Гаметоциты P. falciparum созревают через пять морфологически различных этапов, что занимает примерно 1-2 недели. Культура гаметоцитов, описанная в этом протоколе, завершается за 15 дней и заразна для комаров с 15-18 дней. Эти протоколы были разработаны для поддержания непрерывного цикла заражения компетентными гаметоцитами и для поддержания бесперебойного снабжения комаров стадиями паразита. Здесь мы описываем методологию культивированию гаметоцитов и то, как заразить комаров этими паразитами с помощью стеклянных мембранных кормушек.

Introduction

Малярия вызывается паразитами Plasmodium и передается их позвоночным хозяевам через инфекционный укус самок комаров Anopheles. Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) за 2019 год, было зарегистрировано 405 000 смертей из 228 миллионов случаев^{малярии1.} Большинство случаев смерти от малярии было сосредоточено в африканском регионе, особенно среди детей в возрасте до пяти лет. В то время как общий уровень заболеваемости малярией снизился во всем мире с 2010 года, в последние годы спад стабилизировался, и для ликвидации этого заболевания срочно необходимы дополнительные стратегии борьбы.

Циклические стадии бесполой крови малярийных паразитов вызывают патогенез заболевания, и небольшое подмножество из них дифференцируется на женские и мужские гаметоциты. Гаметоциты Plasmodium falciparum уникальны по своей природе, так как им занимает 7-10 дней для развития через пять морфологически различных стадий. Незрелые гаметоциты от I до IV стадии секвестрируются в паренхиме костного мозга и в значительной степени остаются отсутствующими в периферическом кровообращении^2,3,4,5. Эритроциты, инфицированные зрелыми гаметоцитами V стадии, высвобождаются в кровотоке и свободно циркулируют, чтобы быть захваченными комарами. Попав внутрь москитовой средней кишки, гаметоциты активируются, посредством изменения температуры и воздействия среды средней кишки, трансформируются в женские и мужские гаметы и начинают развитие стадий комара, которое завершается инфекционными стадиями спорозоитов в слюнных железах комара^6,7.

С тех пор, как Трагер и Дженсон⁸ описали стандартизированный метод культивирования P. falciparum,исследования стадий беспологий крови значительно продвинулись. Однако отсутствие надежной системы культивовки половых стадий затруднило изучение гаметоцитов P. falciparum, биологии передачи и стадий комаров. В последние годы было опубликовано несколько методов, которые помогли лабораториям в создании культур гаметоцитов^9,10,11,12. Эта рукопись описывает стандартизированный и надежный протокол к культуре гаметоцитов P. falciparum, который может представлять собой ценный ресурс для сообщества исследователей малярии. Этот метод обеспечивает надежную выработку зрелых и инфекционных гаметоцитов, что наряду со стандартизированным протоколом кормления комаров приводит к высоконадежной инфекционности комаров. Эти методы были установлены для поддержания бесперебойного снабжения гаметоцитами и паразитами стадии комаров. В этой рукописи мы описываем тщательный протокол посева гаметоцитов(Рисунок 1),приготовление кормушек со стеклянной мембраной и заражение комаров с помощью этих мембранных кормушек(Рисунок 2),рассечение средней кишки(Рисунок 3)и слюнных желез комаров(Рисунок 4),а также количественную оценку инфекции у комаров после рассечения средней кишки и слюнных желез.

Protocol

Анализы крови, описанные ниже, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Джона Хопкинса. P. falciparum культивируется в свежих эритроцитах в стерильных условиях на объекте уровня биобезопасности 2 (BSL2), и осторожность используется для обработки биологических…

Representative Results

Здесь мы представляем результаты серии мембранных кормов с использованием культур гаметоцитов P. falciparum NF54, полученных с использованием протокола выше (см.рисунок 5). Культура гаметоцитов была начата примерно с 0,5% смешанной стадии бесполой культуры на 0-й день, котор?…

Discussion

Методы, описанные здесь, успешно используются в Научно-исследовательском институте малярии Джона Хопкинса более 10 лет^{15,16,17,18,19,20,21,22.} Гаметоц…

Materials

10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media