Præsenteret her er protokollen af Conpokal teknik, som kombinerer konfokale og atomare kraft mikroskopi i et enkelt instrument platform. Conpokal giver samme celle, samme region, nær samtidig konfokale billeddannelse og mekanisk karakterisering af levende biologiske prøver.
Teknikker til rådighed for mikro- og nano-skala mekanisk karakterisering er eksploderet i de sidste par årtier. Fra videreudvikling af scanning og transmission elektron mikroskop, til opfindelsen af atomare kraft mikroskopi, og fremskridt i fluorescerende billeddannelse, har der været betydelige gevinster i teknologier, der gør det muligt at studere små materialer. Conpokal er en portmanteau, der kombinerer konfokal mikroskopi med atomare kraft mikroskopi (AFM), hvor en sonde “stikker” overfladen. Selv om hver teknik er yderst effektiv til den kvalitative og / eller kvantitative billedsamling på egen hånd, Conpokal giver mulighed for at teste med blandet fluorescens billeddannelse og mekanisk karakterisering. Designet til næsten samtidig konfokal billeddannelse og atomare kraft sondering, Conpokal letter eksperimenter på levende mikrobiologiske prøver. Den ekstra indsigt fra parret instrumentering giver co-lokalisering af målte mekaniske egenskaber(f.eks.elastisk modulus, vedhæftning, overfladetydlighed) med subcellulære komponenter eller aktivitet, der kan observeres ved konfokal mikroskopi. Dette arbejde giver en trin for trin protokol for driften af laserscanning konfokale og atomare kraft mikroskopi, samtidig, for at opnå samme celle, samme region, konfokale billeddannelse, og mekanisk karakterisering.
Mikro- eller nanoskala mekaniske evalueringsværktøjer anvendes ofte til at afdække deformationsegenskaberne på enkeltcelle- eller mikroorganismeniveau, mens der anvendes separate mikroskopiske værktøjer med høj opløsning til at visualisere delcellulære processer og strukturelle træk. Conpokal, er kombinationen af laserscanning konfokal mikroskopi og atomare kraft mikroskopi (AFM) i en enkelt instrumental platform. Conpokal-teknikken blev først implementeret i et ikke-biologisk polymersystem, hvor målet var at bestemme vedhæftning, elasticitet og overfladespænding af hårde overflader i kontakt med bløde overflader. Konfokale billeder gav en visuel gengivelse af, hvordan polymeren deformerer, klæber og frigiver fra den hårde sonde1,2. Fra polymerer til biologiske prøver, denne teknik giver mulighed for næsten samtidige levende celle eller mikroorganisme konfokal billeddannelse og AFM.
Ændringer i cellerelasticiteten har været impliceret i patogenesen hos mange sygdomme hos mennesker3 herunder vaskulære lidelser4Malaria5,6, seglcelle anæmi7Gigt8Astma9, og kræft6,10,11,12,13,14,15. Fælles teknikker til at måle mekanikken i celler omfatter brugen af magnetiske perler16,17, optisk pincet18,19, micropipette aspiration8,20,21,22, og AFM11,23,24,25,26. Siden anvendelsen af AFM på levende celler, er det let blevet tilpasset til at karakterisere celletopografi27,28 samt mekaniske egenskaber11,24,29,30,31 med nanoskalapræcision. AFM er blevet yderligere tilpasset til mikrorheologi32,33, frekvensmodulering34,35, og krybe25,36,37 forsøg med at studere de viskoelastiske egenskaber af forskellige cellelinjer. Anvendelsen af en passende nanokontaktmodel er afgørende for udvindingen af kvantitative elasticitetsværdier fra afm-producerede kraftindrykningsmålinger1,2. AFM-undersøgelser, der undersøger cytoskeletals lægemidlers indflydelse på celleryasticiteten, har vist, at den elastiske modulus er stærkt påvirket38. Baseret på de elastiske modulus målinger, mange forskere har vist, at kræftceller er blødere end deres ikke-transformerede modparter11,38,39. Øget deformabilitet sandsynligvis spiller en fremtrædende rolle i evnen af kræftceller til at metastasere og infiltrere væv40. En sådan adfærd er reguleret af ændringer i den cytoskeletale organisation af celler38,41,42. Ud over kræft, en anden klasse af mekanisk-afhængige sygdomme er luftvejssygdomme. For eksempel, akut respiratorisk stress syndrom påvirker flere og flere mennesker hvert år. Det har vist sig, at når patienter sættes på mekanisk ventilation, med høje koncentrationer af ilt, kan deres tilstand forværres43. I en række undersøgelser observere alveolær epitel makrofager med AFM, fandt forskerne, at tilsætning af en ilt-rige miljø øget stivhed af celler på grund af actin dannelse; et godt eksempel på den indvirkning, som AFM har på vores detaljerede forståelse af atmosfærisk miljømæssig indflydelse på respiratoriske funktion på celleniveau og i sidste ende, menneskelig helbredelse og sundhed44,45,46. Epitelcellestivhed under migration mod et sår kan også vurderes via AFM, og at der opstår en variation i elastisk modulus for at signalere fremtidig cellespredning47,48. Derfor er der et praktisk behov for at måle cellemekanik kvantitativt for at forstå, hvordan syge celler adskiller sig fra, og interagere med, sunde.
AFM bruges også til at studere klæbende egenskaber og overfladestruktur. En atomare kraft mikroskop har en række forskellige tilstande til at indsamle oplysninger om en prøve ved hjælp af kontakt mekanik. For levende biologiske prøver er to af de primære mål at opnå kvantitative mekaniske egenskabsværdier(f.eks. elastiskmoduli, klæbekræfter) samt kortoverfladehøjde. Disse tilstande omfatter trykke tilstand (også kendt som intermitterende kontakt), som opretholder en konstant cantilever amplitude intermitterende kontakt prøven overflade og kontakt tilstand, som hæver eller sænker cantilever at opretholde en konstant afbøjning49. Vedhæftning kort kan indsamles ved hjælp af kraft kortlægning på AFM-systemet. Den cantilever indrykning prøven til en vis kraft og trækkes derefter tilbage. Den kraft, der modstår tilbagetrækning, måles af detektoren for at generere en kraftforskydningsgraf. Vedhæftningskraften er den maksimale kraft, der måles under tilbagetrækningen. Overflademorfologi giver et detaljeret overblik over prøven på mikro- eller nanoniveau. Den cantilever fuldender en raster scanning på tværs af prøven baseret på indrykning og afbøjning fanget af bevægelsen af cantilever på hver pixel, afslører mikro- og nano-størrelse funktioner. Med AFM, størrelsen af små funktioner såsom peptidoglycan struktur50, polymer kædejustering51, flagella52, laellipodia53, og filipodia54 kan måles. Mens AFM magt ligger i kraft-forskydning kurver og ikke-optiske topologiske billeder, konfokale mikroskopi tilbyder detaljerede billedbehandling af fluorescerende mærkede prøver.
Konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM) er en dominerende teknik til billeddannelse af levende celler, faste celler og væv55,56,57. CLSM har været ansat til biologisk billeddannelse siden 1955, dvs. Mens arbejdsprincippet for konfokale mikroskoper (dvs.afvisning af ud af fokus lys gennem et pinhole) har været stort set det samme, den tekniske gennemførelse er blevet megetforskelligartet 56,57,58,60. Konfokal billeddannelse kan implementeres via multipunktsscanning, som i et roterende disksystem61, punktscanning af en enkelt laserstråle, som i linjescanning62, eller billeddannelse af punktspredningsfunktionen med efterfølgende pixelskifte via et multidetektorelement57. De seneste fremskridt, der udvider nytten af konfokale billedbehandling omfatter laserscanning kapacitet, høj hastighed resonans scanning, og høj følsomheddetektorer 63,64,65. Fordelen ved, at alle konfokale systemer har over widefield mikroskoper er evnen til at udføre optisksektion i z aksen med flere detaljer, især i tykke prøver. Widefield-mikroskoper, der bruger kamerabaseret detektion, indsamler lys, der udsendes fra brændplanet, og samtidig lys, der udsendes overalt i belysningsvejen. Ved at lukke pinhole, på bekostning af at reducere signalet, både den aksiale og laterale opløsning kan øges66. I CLSM opbygges billeder pixel for pixel gennem indsamling af emissionssignaler, da en excitationslaser scannes på tværs af et x-y synsfelt. Indsamling af flere x-y-planer langs prøvens z-akse kan derefter bruges til at rekonstruere den 3-dimensionelle arkitekturi prøven 57,67. Konfokal mikroskopi i forbindelse med indførelsen af fluorescerende proteiner, har revolutioneret vores forståelse af cellebiologi68. For eksempel er det blevet et vigtigt redskab i neurovidenskab69. CLSM bruges regelmæssigt til at observere renset væv, og for at opnå omfattende billeder af immun farvede hjerne og neuronal netværk arkitektur70. Denne applikation har resulteret i ny indsigt i synaptiske kontakter og kommunikation blandt neuroner og gliaceller i hjernen71. Fra hjerneceller til vesikler understøtter fluorescerende farvningsprotokoller inspektion og indfangning af cellefunktioner via konfokal mikroskopi for fremskridt inden for terapeutisketeknikker 72,73.
Selv om de er imponerende og alsidige værktøjer individuelt, kombinationen af konfokale og atomare kraft mikroskopi (Conpokal) giver forskerne mulighed for entydigt korrelere topografiske og mikromekaniske cellulære / væv egenskaber med observation af forskellige cellulære organeller og deres respektive dynamik. Parret instrumentering giver brugerne mulighed for at, hovedsagelig, “se” hvad de er sondering; en kæmpe fordel i forhold til en teknik på egen hånd. Med Conpokal overlejres kraftkortlægning gennem AFM på konfokale billeder for at korrelere cellestivhed, vedhæftning eller morfologi til den cytoskeletale struktur i prøven, f.eks. Det overordnede mål med Conpokal-metoden er at skabe en platform for forskere til at studere levende prøver på en kortfattet og effektiv måde, der giver både billed- og materialeejendomsdata på en enkelt platform. I dette arbejde demonstrerer vi driften af Conpokal, herunder korrekt udvælgelse og forberedelse af prøver, instrumentopsætning, cantilever kalibrering og giver retningslinjer for vellykket fejlfinding. Efter protokollen, giver vi repræsentative resultater, der omfatter vellykkede bakterier og celle AFM højde kortlægning, bakterier og celle AFM modulus kortlægning, og konfokal billeddannelse af multi-mærket celler, gennem samme celle konfokale og AFM. Vi afslutter med en diskussion af Conpokal-procedurens kritiske trin, fejlfindingsanbefadninger, teknikbegrænsninger, betydning og fremtidsudsigter for metoden.
Conpokal er en avanceret, effektiv teknik til indsamling af billeder af høj kvalitet og in situ mekaniske egenskaber af levende biomaterialer i et flydende miljø. Evnen til at indsamle ekstraordinære morfologi og topografi billeder kombineret med levende-prøve mekaniske egenskaber strækker sig forbi typiske elektron og lys mikroskopi teknikker. Separat, en konfokal mikroskop giver brightfield, epifluorescens, og laser scanning konfokale kapaciteter til at opnå høj kvalitet, detaljerede fluorescerende billeder af prøver. En AFM giver mekanisk karakterisering, men uden ekstra optik bliver det vanskeligt at navigere i prøven. Med de to systemer kombineret, kan en bruger indsamle både billeder og mekaniske egenskaber af nøjagtig samme celle under eksperimentet, hvilket er en stor fordel i forhold til to separate instrumenter. Formålet med dette manuskript er at informere og vejlede brugerne om de omfattende muligheder i det kombinerede Conpokal system for fremtiden for biologi, teknik og sundhed. Protokollen indebærer forberedelse af instrumenter, kultur medier, retter, udvælgelse af mikroorganismer, AFM procedure, konfokal procedure, og oprydning. De mest kritiske skridt for en vellykket live, in-løsning, Conpokal session er prøve immobilisering, velovervejet tip udvælgelse, og levende plet udførelse. Diskussionsafsnittet til dette manuskript vil uddybe kulturanbefadinger, fejlfindingstips og operationelle retningslinjer og fremtidigt arbejde for Conpokal-teknikken. Kulturanbefadenede vil omfatte vejledning om stikprøvekultur, immobilisering og farvning. AFM, confocal, og Conpokal tips og retningslinjer vil diskutere tip udvælgelse og kalibrering, opløsning, begrænsninger, og nær samtidig drift. Det fremtidige arbejde omfatter udsigterne og potentialet for potentielle forskningsforløb.
Protokollen dækker kultur, sondering og billeddannelse af både levende celle og faste bakterieprøver. En udfordring til stede, når de udfører AFM i væske stammer fra cantilever bevægelse obstruktion på grund af prøvehindring og hydrodynamisk træk. Hvis prøven ikke er godt i klæbet til underlaget, er der risiko for tilsmudsning af udkræjsning af den udkræjnede ved dele af prøven, der flyder i væsken. I så fald kompromitteres målingerne, da de er en formodning af elastisk klæbende og mikromekaniske egenskaber ved prøven. HEK-cellerne blev ikke behandlet med fiksative, men S. mutans og E. fæecalis kræver yderligere immobilisering, svarende til andre prokaryote celler. De valgte bakterier viste aktiv bevægelse, som hindrede celle sondering og billeddannelse, derfor blev prøverne forsigtigt, kemisk fastgjort for at fremme immobilisering. Der er alternativer til kemisk fiksering, såsom filtermembraner, der fysisk fanger individuelle celler i porerne75.
Valg af tip er også en vigtig komponent i opsætningen og driften af AFM. Når mekaniske egenskaber baseret på deformation af biomaterialet søges, må man overveje cantilever stivhed og materiale stivhed kompatibilitet, som er en ikke-triviel opgave. Hovedformålet er at bedst matche materialets stivhed med stivheden af den valgte cantilever. Hvis cantilever er meget blødere end prøven, vil det være genstand for for meget afbøjning. Hvis cantilever er stivere end prøven, så AFM detektoren kan være i stand til at fange sådanne små afbøjninger. Det anbefales, at når du vælger en egnet AFM cantilever, at vælge baseret på eksperimentel anvendelse. For at indsamle detaljerede billeder i intermitterende kontakttilstand er AFM-spidser inden for en rækkevidde på 0,1 – 0,3 N/m for stivhed og spidsradius inden for 5 nm – 100 nm effektive til levende cellebilleddannelse. Små koniske spidser anbefales. Skarpe spidser giver et lille kontaktområde og evne til at indrykke yderligere medvirken til indsamling af små detaljer og funktioner i prøvemorfologi76. Skarpe spidser kan dog også være problematiske, da de er tilbøjelige til at punktere prøver, når indstillingerne(f.eks.sætpunkt, pixeltid, indrykningshastighed) kræver for meget indrykning, eller indrykningen er for hurtig. For at undgå høj belastning sats effekter, lokale stamme hærdning nær en skarp spids, eller blot at styre kontaktområdet og tilgang hastighed, mange vælger at bruge kraft spektroskopi med en kolloid spids til at måle en elastisk modulus.
AFM spidser inden for en rækkevidde på 0,01 – 1,0 N/m for stivhed og spidsradius inden for 1 – 5 μm anbefales at måle den elastiske moduli af levende celler. Store spidsstørrelser, typisk glas kolloider, giver et kendt kontaktområde og er usandsynligt, at punktere cellen, mens i kontakt. Rektangulære kantilever foretrækkes frem for trekantede, fordi den kontaktfrie metode under kalibrering kan anvendes til rektangulær geometri sammenlignet med kontaktbaseret kalibrering for trekantede geometrier. Også på grund af den delikate karakter af AFM tips, anbefales det, at operatøren gennemfører pincet med gummi tips til at reducere risikoen for at beskadige den delikate AFM chip eller montering blok. Andre parametre, der skal være opmærksomme på, omfatter indflyvningshastigheden af AFM-spidsen og mængden af indrykning i prøven. En god retningslinje er at holde indrykning til omkring 10% af tykkelsen (eller højden) af prøven og vælge en hastighed, der udelukker potentielle hydrodynamiske modstand opleves af cantilever38.
Indviklede eksperimentelle instrumenter leveres typisk med vejspærringer, der kræver fejlfinding i instrumentet, der er konfigureret, kalibrering og drift. Crashing AFM spidsen eller cantilever i prøven eller prøve substrat er en almindelig fejl for nye brugere. For at undgå dette problem foreslår protokollen at støtte cantilever ud 2000 μm. Dette trin sikrer, at spidsen ikke kommer i kontakt med bunden af skålen, hvis den tidligere bruger har glemt at bakke spidsen ud, når oprydning efter forsøg. Afstanden på 2000 μm blev dog valgt for den valgte parabolholder, der anvendes i denne protokol. Det kan være nødvendigt at vælge et andet område, større eller mindre, afhængigt af den retholderstil, der anvendes. Under justering af laser og detektor, protokollen nævner justering af et spejl knop for at maksimere sumsignalet. Der er muligvis ikke en spejljusteringsknap på alle AFM’er. Hvis den findes, er en måde at manipulere instrumentet til fejlfinding af et lavsum signal imidlertid ved at justere spejlknappen, der bruges til at tage højde for det medium, hvor scanningen finder sted. enten væske(f.eks.vand, medier, PBS) eller luft. På grund af forskellen i brydningsindeks for lys gennem luft og gennem væske kan det være nødvendigt at justere spejlknappen. AFM-cantileverens maksimale bøjningsfølsomhed vil være på afm-spidsens placering, derfor skal laserlyset, som returnerer bøjningspositionen gennem dens placering på en fotodiode, være placeret på afm-spidsens placering. Afhængigt af den valgte AFM-spids kan den samlede signalværdi variere fra 0,3 til 3,0 V. En bagside belægning på AFM cantilever såsom Cr-Au eller Al vil øge sumsignalet og følsomheden af målingen.
Tipgeometri er relevant, når du fuldfører kalibrering af spids under AFM-drift. Der er konstateret god enighed mellem ikke-kontakt- og kontaktkalibrering. Hvis den valgte AFM cantilever ikke er rektangulær, skal der udføres kontaktkalibrering. Husk, at det medium, hvor spidsen kalibreres, skal være det samme som prøvemediet. Hvis disse væsker er forskellige, skal brugeren kalibrere igen. Ved brug af AFM-spidserne i væske skal den frekvens, der måles af systemet, være en fjerdedel til en tredjedel af den naturlige resonansfrekvens, som fabrikanten har angivet. En god måde at kontrollere, at systemet kalibrerede spidsen korrekt, er at kontrollere værdierne i den termiske støjfil, der genereres. Kontroller, at denne fil gemmes i den relevante mappe. Hvis systemet har problemer med kalibrering eller ikke-sandsynlige værdier kommer ud, rekalibrere, eller justere laser position lidt derefter kalibrere.
En anden årsag til dårlig sum signal kan skyldes AFM cantilever tilpasning. Når AFM-chippen er monteret i glasblokken, er det vigtigt, at spidsen af cantilever forbliver inden for det lille laservindue (glat glasområde). Hvis chippen er for langt frem, kan den vinkel, hvor den cantilever naturligt hviler, forårsage et problem med refleksionen fra udkræsken, mangler fotodetektoren og resulterer i dårligt sumsignal. Hvis chippen er for langt tilbage, vil laseren ikke være i stand til at reflektere ud på bagsiden af cantilever, forårsager dårlig sum signal. Af disse grunde kan det være nødvendigt at justere den monterede AFM-chip. Derudover opstår et andet problem, der kan opstå, i prøvens højde. Det AFM-instrument, der anvendes i denne protokol, har en maksimal piezo z-rækkevidde (højde) på 15 μm. Hvis en bruger finder ud af, at softwaren ikke er i stand til at indsamle højdedata og tvinge kort i en bestemt pixel, vises en sort boks, der angiver, at systemet er uden for området (Figur 2C). En måde at problemer skyde dette problem er at indstille piezo højde til en lavere værdi, såsom 2 eller 3 μm, så det meste af de 15 μm rækkevidde er forpligtet til at kortlægge den forventede højde af cellen. Denne teknik bør i de fleste celle- eller bakterierelaterede eksperimenter løse det problem, der er forbundet med z-området.
Forsøgseksperter, der kræver en udvidet z rækkevidde for høje prøver med højder større end 10 – 15 μm kan være nødvendigt at forfølge et ekstra modul på AFM. AFM-producenter har denne mulighed til rådighed til ekstra omkostninger for de fleste systemer. Ved at udvide z-området har experimentalisten mulighed for at scanne prøver, der betragtes som høje på mikroskalaen med få problemer for værdier uden for området eller AFM piezomotorændring. Selv om disse moduler koster ekstra, nogle, afhængigt af producenten, kan tilbyde ekstra højde, op til 100 μm i z retning. Konfokale er stadig muligt med højere prøver, hvis brugeren har en lang arbejdsafstand, høj forstørrelse mål eller er villig til at bruge en luft mål, måske en 20x eller 40x. Ved at sænke mikroskop objektive forstørrelse, arbejdsafstanden stiger, få afstand til at se toppen af en højere prøve. Denne ændring af en lavere forstørrelse mål vil ofre opløsning. I Conpokal-opsætningen, der henvises til i dette manuskript, har 60x TIRF-målet (total intern refleksionsfluorescens) en arbejdsafstand på næsten 100 μm forbi dækslet på prøveskålen med glasbund.
Med hensyn til det konfokale mikroskop, der henvises til i dette manuskript, drøftes nogle få vigtige bestemmelser. Det konfokale system, der anvendes til fremstilling af tallene i dette manuskript, gennemførte et 60x TIRF-oliemål med en numerisk blændeåbning på 1,49. Laserledninger ved 405 nm, 488 nm og 561 nm excitation bølgelængder blev anvendt til levende celle prøve billeddannelse, vist i figur 3 og figur 4. Den diffraktion grænse konfokale mikroskop kan bestemmes ved hjælp af Abbe Resolution ligning, Abbe Resolution (x,y) = λ/2NA, hvor λ er excitation bølgelængde for Alexa 488, ved 488 nm, og NA er den numeriske blænde for konfokal kondensator, som er 0,3. Derfor bestemmes en aksial opløsning på 272 nm. For epifluorescence-billeddannelse overvejes to tilfælde for at bestemme den opløsning, hvor pinholeet er indstillet til en luftig enhed (AU) og 0,5 AU. I sidstnævnte tilfælde er pinhole lukket ned, således at betydelige lystab opstår, men opløsningen stiger. Den konfokale software beregner laterale indfødte og aksiale indfødte opløsninger ved 170 nm og 290 nm for pinhole ved 0,5 AU, og 200 nm og 370 nm for pinhole ved 1 AU, hhv. Sfæriske afvigelser indført i systemet kan gøres rede for gennem en deconvolution proces for at øge kontrast og opløsning i mikroskop billeder. På grund af de diffraktionsbegrænsninger, der er forbundet med konfokale mikroskoper, mangler bakteriekoloniens konfokale billede i figur 6 den matchende opløsning for de detaljer, der ses i AFM-scanningen af bakterier i figur 5. AFM giver adgang til nanoskala funktioner og detaljer, der er vanskeligt at fange med en konfokal mikroskop. Afhængigt af den nødvendige fluorescensopløsning viser figur 5 og figur 6 imidlertid, at Conpokal-teknikken finder anvendelse på mikrober ud over eukaryote celler.
En fordel ved at bruge et konfokalt mikroskop gør det muligt for operatøren at indsamle 3D-billeder af bestemte områder i en prøve med skærpede detaljer. Disse billeder korrelerer med AFM ved at se overfladen, der blev undersøgt via AFM billedet og en konfokal scanning af samme region. Da mikroskopet er inverteret, indsamler et epifluorescensbillede lysoplysninger fra den modsatte side af prøven, der blev undersøgt. Pinhole i konfokale system hjælper med at begrænse til et enkelt plan fra en vis afstand, mens filtrering ud lys, der kommer fra resten af prøven eller endda rummet. I bund og grund hjælper pinholeet med at isolere det lys, der kommer tilbage fra det enkelte sted af interesse i prøven. Typisk, dette plan af interesse skal indeholde stærke fluorophore markører, fordi, for inverterede konfokale systemer, enkelt molekyle detektion ville være begrænset til højere opløsning konfokale mikroskoper. Epifluorescens belysning er mindre ønskeligt på grund af det faktum, at i epifluorescens billeddannelse tilstand, ethvert lys fra prøven, der afspejles i målet indsamles og bruges til at generere billedet, derfor umuligt at isolere et enkelt plan. Konfokale teknikker giver et mere isoleret enkeltplanbillede af den pågældende prøvefunktion på grund af pinhole77. Hvis for eksempel toppen af en eukaryote celle er undersøgt af AFM, at samme overflade kan isoleres med laser scanning konfokale kapaciteter af mikroskopet, snarere end med epifluorescens billeddannelse tilstand. Det anbefales at overvåge cellernes sundhed/form under dataindsamling via billeddannelse samtidig i differenskontrasttilstand ved hjælp af den transmitterede lysdetektor og 488 nm laserlinjen. Ved optagelse af en z stak af prøven, for proceduren beskrevet ovenfor, kun gevinsten af detektoren justeres. Enhver morfologisk ændring i cellerne under målingen, som ikke nødvendigvis er synlig i lysstofrør, indikerer, at artefakter indføres i målingen.
Ideel afstand mellem fly kan opnås ved at følge software anbefaling for den korteste bølgelængde, der anvendes i billeddannelse teknik. Den oprindelige opløsning og signal til støj-forholdet i billedmængderne kan forbedres effektivt ved at anvende deconvolution algoritmer til rådighed i billedbehandling modul af erhvervelsen software. Men, udfører fluorescerende mikroskopi, udvælgelse af specifikke pletter og farvestoffer er afgørende for at undgå tidligt på sæt blegning eller krydstale fra overlappende excitation / emission spektre. Nogle gange kan en bruger opleve en fejl i konfokal lysgenerering. Hvis en bruger oplever mangel på lysemission eller fejlbehæftede laserlinjer, er en måde at foretage fejlfinding på at nulstille systemet, typisk ved at genstarte driftssoftwaren. Hvis problemet fortsætter, kan den transmitterede lysdetektor ikke være blevet bevæget ind på eller uden for stedet inden for lysmikroskopets optiske bane. Nulstilling af senderdetektorens position kan bidrage til at afhjælpe problemer med lyssamling eller laserscanning.
Conpokal-instrumentet fokuserer på at give brugerne mulighed for at indsamle optiske og kraftbaserede oplysninger om levende biomaterialer i et flydende miljø, samtidigt og på samme celle eller funktion. Dette arbejde beskriver udtrykkeligt, hvordan man udfører disse eksperimenter i væske, et naturligt hjem for mange biomaterialer, selv om, tørre eksperimenter kan stadig udføres ved hjælp af instrumentering. Med prøver tilberedt i petriskåle er skålhøjden en begrænsning. På grund af konfigurationen af glasblokken, der holder AFM cantilever, skal sidevæggene af retterne være under 10 mm i højden; Hvis skålen er for høj, vil instrumentet ikke være i stand til at sænke AFM-spidsen til prøvens eller underlagets overflade.
Selv om der er en begrænsning for stikprøvestørrelsen, er der ingen begrænsning med instrumentet eller software kapaciteter med hensyn til en tidsforsinkelse. Samtidig konfokale og AFM er muligt med de rigtige faktorer på plads. Den begrænsning, der bidrager til dens næsten samtidige kapacitet refererer til den støj, der genereres, når de udfører visse konfokale mikroskopi funktioner og atomare kraft mikroskopi funktioner samtidigt. Vibrationerne fra de motorer, der flytter mikroskopmålet under indsamling af en z-stak, føjes til signalet fra AFM-sondens spids under dens bevægelse. Støjen vil blive forstærket af et oliemål, når motorerne bevæger sig op og ned i z-retningen for at belyse sekventielle planer i prøven. Derfor omfatter den anbefalede protokol sekventiel samling af AFM-scanninger og konfokale z stack-billeder. Samtidig CLSM og AFM ville kræve stationær billeddannelse med konfokalen, men med den nuværende teknik kan forsinkelsestiden for de to instrumenter være så kort som ti sekunder. Den faktiske tid til at skifte fra AFM-drift til konfokal billeddannelse var omkring 2 – 4 minutter for de billeder, der blev indsamlet i figur 2A og figur 4B. Denne værdi blev bestemt ved at trække de to billedsamlingsperioder fra den samlede tid på 33 minutter, hvilket omfatter den tid, der skal til for at starte og fuldføre AFM-scanningen, skifte instrumenttilstande for at aktivere konfokal billeddannelse og begynde og fuldføre den konfokale billed z-stak.
Fremtiden for Conpokal har til formål at udforske nye struktur-funktion relationer ud over skarp indsigt i enkelt celle processer. For eksempel, eksperimentering af in situ narkotika behandlinger på celle eller bakterielle prøver til at bestemme virkningerne af celle elasticitet ville være et fremskridt til områderne biomaterialer, biologi, og biomekanik. Behandlingsbehandling i prøveskålen, mens billeddannelse og sondering ville give viden om, hvordan prøven reagerer på terapeutiske forhold i et levende og omhyggeligt kontrolleret miljø, over tid. Indarbejde en ny narkotika eller miljømæssig udfordring ville udvide forståelsen af, hvordan cytoskeleton eller organelle placering påvirker bevægelse, topologi, stivhed, osv. En anden potentiel udvikling af Conpokal er evnen til at have fuldstændig miljøkontrol af systemet. Den nuværende Conpokal nævnt i denne protokol er anbragt inde i en akustisk kabinet designet til at reducere støj inde fra laboratoriet. Fremme af dette hus ville give mulighed for at teste inden for, måske, en eller en kombination af faktorer, ikke begrænset til dem, såsom et sterilt miljø, temperatur-kontrolleret, eller endda variabel tyngdekraft. Som det ser ud nu, conpokal metode giver en effektiv og nyttig tilgang til at karakterisere levende, i-flydende biomaterialer, men fremtiden for teknikken vil kun fremme disse kapaciteter yderligere.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender NIH COBRE finansiering under nummer P20GM130456. Vi takker uk Light Microscopy Core, som støttes af Vice President for Research, for at få hjælp til dette arbejde. Stammer af S. mutans og E. fæecalis blev leveret af Dr. Natalia Korotkova. Den første omtale af play-on-ord, Conpokal, at beskrive kombinationen af konfokale mikroskopi og atomare kraft mikroskopi tilskrives Dr. Brad Berron, Chemical and Materials Engineering, ved University of Kentucky, i diskussion med Dr. Martha Grady (tilsvarende forfatter) i forventning om ankomsten af et seminar højttaler Dr. Jonathan Pham, der sluttede fakultetet i Chemical and Materials Engineering ved University of Kentucky i efteråret 2017.
Acoustic Enclosure | JPK-Bruker | Acoustic Enclosure | Chamber used to mitigate noise |
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Millipore Sigma | SCT142 | Used to label microtubules in mammalian cells |
CP-qp-CONT-BSG AFM tips | NanoAndMore | CP-qp-CONT-BSG-B | Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples |
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | ThermoFischer Scientific | D282 | Used to label plasma membrane of mammalian cells |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | VWR | VWRL0100-0500 | Component of cell culture media |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285601 | Used to simulate biological environment |
Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 45000-736 | Component of cell culture media |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fischer Scientific | BP1422-500 | Component of bacterial culture medium |
FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments (WPI) | FD35-100 | Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM |
Hoechst 33342 nucleic acid stain | ThermoFischer Scientific | 62249 | Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells |
Human embryonic kidney 293 cells | ATCC Global Bioresource Center | CRL-1573 | Mammalian cells used in protocol |
Matrigel | VWR | 47743-716 | Coating in cell culture dish |
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips | Bruker | PFQNM-LC-A-CAL | AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells) |
NanoWizard 4a | JPK-Bruker | NanoWizard 4a | AFM |
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | A1 HD25 | Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging |
PENICILLIN/STREPTOMYCIN | VWR | 16777-164 | Component of cell culture media |
PetriDishHeater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | Maintains desired Petri dish sample temperature |
qp-BioAC-Cl AFM tips | Nanosensors | qp-BioAC-Cl-10 | Three different AFM cantilevers of varying stiffness |
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers | Ted Pella Inc. | 5051 | Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block |
Todd Hewitt Broth Bacto | BD DIFCO Bacterius Ltd | Bacto-249240 | Component of bacterial culture medium |
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate | Thermo Fisher Scientific | V34850 | Used to fluorescently label bacterial cell wall |