Super-resolution Imaging at studere co-lokalisering af proteiner og synaptiske markører i primære neuroner
Summary
Denne protokol viser, hvordan man anvender super-opløsning mikroskopi til at studere protein co-lokalisering i primære neuronale kulturer.
Abstract
Synapser er de funktionelle elementer af neuroner og deres defekter eller tab er på grundlag af flere neurodegenerative og neurologiske lidelser. Imaging undersøgelser er almindeligt anvendt til at undersøge deres funktion og plasticitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grund af deres størrelse og struktur kræver lokaliseringsundersøgelser af proteiner billedbehandlingsteknikker med høj opløsning. I denne protokol beskriver vi en procedure til undersøgelse i primære neuroner co-lokalisering af målproteiner med synaptiske markører på et superopløsningsniveau ved hjælp af struktureret belysningmikroskopi (SIM). SIM er en mønstret lys belysning teknik, der fordobler den rumlige opløsning af wide-field mikroskopi, nå en detalje på omkring 100 nm. Protokollen angiver de nødvendige kontrolelementer og indstillinger for robuste undersøgelser af sam lokalisering og en oversigt over de statistiske metoder til at analysere billeddataene korrekt.
Introduction
Synapsens forståelse og synsbillede har ændret sig enormt siden den første beskrivelse af Foster og Sherrington i 18971. Siden da er vores viden om neuronal kommunikation og de molekylære processer bag den vokset eksponentielt2. Det er blevet klart, at synapser kan opfattes som et system med to rum: et præsynaptisk rum, der indeholder vesikler til frigivelse af neurotransmittere og et postsynaptisk rum med receptorer3. Denne forsimplede opfattelse, i de sidste tyve år, har udviklet sig til et komplekst netværk af de proteiner, der kræves for at transduce sender binding til signalering4.
Gevinsterne i forståelsen skyldes delvis super-opløsningteknikker,der overvandt diffraktion grænse konventionelle lys mikroskopi, der passer til dimensionen af synapserbedre 5,6,7,8,9,10. På grund af diffraktionsgrænsen kan et optisk mikroskop ikke nå en opløsning over 200 nm sideomside 11,12. For at omgå denne grænse blev der udviklet superopløsningsteknikker ved hjælp af forskellige tilgange og opnåelse af forskellige subdiffraktionsgrænseopløsninger: SIM, STED (Stimuleret emissionsudtømning Mikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) og STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM fordobler den rumlige opløsning af laserbaserede mikroskopisystemer med brede felter ved at indsætte en diffraktionsrist i excitationsstrålens sti15. Den bevægelige rist diffracts laserstråler til at skabe en kendt belysning mønster, normalt striber. Dette bevidst strukturerede lysmønster er overlejret til den ukendte rumlige fordeling af fluorescerende farvestof (af prøven). Interferens frynser dannet af de to mønstre indkode for ellers skelnes fine detaljer med normal wide-field mikroskopi. Det endelige super-løst billede opnås ved at kombinere og afkodning med matematiske metoder flere rå billeder af den samme prøve opnået ved oversættelser og rotationer af diffraktion rist. Opløsningen af de super-løste billeder når 100 nm i side- og 500 nm i aksiale retninger for 2D-SIM15 eller 100 nm i side- og 250 nm i aksiale retninger for 3D-SIM16.
Den nye forståelse af synapsen er endnu vigtigere i lyset af de mange neurologiske lidelser, hvor synaptisk dysfunktion spiller en stor rolle i debut og progression17,18. Alzheimers sygdom, Downs syndrom, Parkinsons sygdom, prionsygdomme, epilepsi, autisme spektrum lidelser og skrøbelige X syndrom blandt andre har været forbundet med abnormiteter i synaptisk sammensætning, morfologi ogfunktion 19,,20,21,22.
For nylig, ved hjælp af et sæt af SUMO-specifikke antistoffer, vi brugte SIM til at vise co-lokalisering i primære hippocampal neuroner af SUMO proteiner med præ- og post-synaptic markører synaptophysin og PSD95 på super-opløsning niveau23. Dette gjorde det muligt for os at bekræfte biokemiske og konfokale mikroskopi beviser for SUMO lokalisering i neuroner.
Her beskriver vi en protokol til at studere lokalisering af proteiner i mus hippocampal primære neuroner. Samtidig kan denne protokol tilpasses til forskellige typer af primære neuronale kulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belysning af synapsens struktur og sammensætning er afgørende for at forstå de fysiologiske og patologiske processer, der regulerer hukommelse og kognition. Mens der i den normale tilstand, synapser er byggestenene i hukommelsen, de også ligger til grund for komplekse neurologiske lidelser såsom Alzheimers sygdom32. Den protokol, der er beskrevet her tjener til at studere co-lokalisering af neuronal proteiner med en super-opløsning mikroskopi teknik kaldet SIM. Ved hjælp af et bestemt belys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Edoardo Micotti for konstruktiv kritik af manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af BrightFocus A2019296F, af Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), af Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) og af Marie Skłwska-Curie Innovative Training Network (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
