Superoppløsningsavbildning for å studere samtidig lokalisering av proteiner og synaptiske markører i primære nevroner
Summary
Denne protokollen viser hvordan du bruker superoppløsningsmikroskopi for å studere proteinkon-lokalisering i primære nevronale kulturer.
Abstract
Synapser er de funksjonelle elementene i nevroner og deres defekter eller tap er på grunnlag av flere nevrodegenerative og nevrologiske lidelser. Imaging studier er mye brukt til å undersøke deres funksjon og plastisitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grunn av deres størrelse og struktur krever lokaliseringsstudier av proteiner høyoppløselige bildeteknikker. I denne protokollen beskriver vi en prosedyre for å studere i primære nevroner samtidig lokalisering av målproteiner med synaptiske markører på et superoppløsningsnivå ved hjelp av strukturert belysningmikroskopi (SIM). SIM er en mønstret lys belysning teknikk som dobler romlig oppløsning av bredfelt mikroskopi, nå en detalj på rundt 100 nm. Protokollen angir de nødvendige kontrollene og innstillingene for robuste sam lokaliseringsstudier og en oversikt over de statistiske metodene for å analysere bildedataene riktig.
Introduction
Forståelsen og synet av synapse har endret seg enormt siden den første beskrivelsen av Foster og Sherrington i 18971. Siden da har vår kunnskap om nevronal kommunikasjon og de molekylære prosessene bak den vokst eksponentielt2. Det har blitt klart at synapser kan tenkes som et to-roms system: et pre-synaptisk rom som inneholder vesikler for frigjøring av nevrotransmittere og et postsynaptisk rom medreseptorer 3. Dette forenklede synet har de siste tjue årene utviklet seg til et komplekst nettverk av proteinene som kreves for å transdusere senderbinding til å signalisere4.
Gevinsten i forståelsen skyldes delvis superoppløsningsteknikker som overvant diffraksjonsgrensen for konvensjonell lett mikroskopi som passer dimensjonen av synapser bedre5,,6,,7,,8,,9,,10. På grunn av diffraksjonsgrensen kan ikke et optisk mikroskop nå en oppløsning over 200 nm side11,,12. For å omgå denne grensen ble det opprettet superoppløsningsteknikker ved hjelp av ulike tilnærminger og når forskjellige sub-diffraksjonsgrenseoppløsninger: SIM, STED (Stimulert utslippsdeplesjonsmikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) og STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM dobler den romlige oppløsningen av laserbaserte bredfelts mikroskopisystemer ved å sette inn en diffraksjonsrist i eksitasjonsstrålebanen15. Den bevegelige risten diffracts laserstrålene for å skape et kjent belysningsmønster, vanligvis striper. Dette med hensikt strukturerte lysmønsteret er lagt over til den ukjente romlige fordelingen av fluorescerende fargestoff (av prøven). Interferenskantene dannet av de to mønstrene koder for ellers umulige fine detaljer med normal bredfeltmikroskopi. Det endelige super-løst bildet oppnås ved å kombinere og dekoding med matematiske metoder flere råbilder av samme prøve oppnådd av oversettelser og rotasjoner av diffraksjonsristet. Oppløsningen av super-løst bilder når 100 nm i lateral og 500 nm i aksial retninger for 2D-SIM15 eller 100 nm i sideveis og 250 nm i aksial retninger for 3D-SIM16.
Den nye forståelsen av synapsen er enda viktigere i lys av de mange nevrologiske lidelsene der synaptisk dysfunksjon spiller en viktig rolle i utbruddet ogprogresjon 17,18. Alzheimers sykdom, Down syndrom, Parkinsons sykdom, prion sykdommer, epilepsi, autisme spektrum lidelser og skjøre X syndrom blant annet har vært knyttet til abnormiteter i synaptisk sammensetning, morfologiog funksjon 19,20,21,22.
Nylig, ved hjelp av et sett med SUMO-spesifikke antistoffer, brukte vi SIM til å vise co-lokalisering i primære hippocampal nevroner av SUMO proteiner med pre- og post-synaptiske markører synaptophysin og PSD95 på superoppløsningnivå 23. Dette gjorde oss i stand til å bekrefte biokjemisk og konfokal mikroskopi bevis på SUMO lokalisering i nevroner.
Her beskriver vi en protokoll for å studere lokalisering av proteiner i mus hippocampal primære nevroner. Samtidig kan denne protokollen tilpasses ulike typer primære nevronale kulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belyse strukturen og sammensetningen av synapsen er avgjørende for å forstå de fysiologiske og patologiske prosessene som regulerer hukommelse og kognisjon. Mens de er i normal tilstand, synapser er byggesteinene i minnet, de ligger også til grunn for komplekse nevrologiske lidelser som Alzheimers sykdom32. Protokollen som er beskrevet her tjener til å studere co-lokalisering av nevronale proteiner med en superoppløsning mikroskopi teknikk kalt SIM. Ved hjelp av et bestemt belysningsmønster…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Edoardo Micotti for konstruktiv kritikk av manuskriptet. Denne studien ble støttet av BrightFocus A2019296F, av Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), av Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) og av Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
