Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto
Summary
Questo protocollo è un metodo efficiente, conveniente e robusto per isolare la microglia primaria dal tessuto cerebrale umano vivo, adulto. Microglia umana primaria isolata può servire come strumento per studiare i processi cellulari in omeostasi e malattia.
Abstract
Le microglia sono cellule immunitarie innate residenti del sistema nervoso centrale (SNC). Microglia svolgono un ruolo fondamentale durante lo sviluppo, nel mantenimento dell’omeostasi e durante l’infezione o lesioni. Diversi gruppi di ricerca indipendenti hanno evidenziato il ruolo centrale che la microglia svolgono nelle malattie autoimmuni, nelle sindromi autoinfiammatori e nei tumori. L’attivazione della microglia in alcune malattie neurologiche può partecipare direttamente a processi patogeni. La microglia primaria è un potente strumento per comprendere le risposte immunitarie nel cervello, le interazioni tra cellule cellulari e i fenotipi di microglia disregolati nella malattia. Le microglia primarie imitano le proprietà microgliali in vivo meglio delle linee cellulari microgliali immortalate. La microglia adulta umana presenta proprietà distinte rispetto alla microglia fetale e roditore umana. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per l’isolamento della microglia primaria dal cervello umano adulto. Lo studio di questi microglia può fornire informazioni critiche sulle interazioni tra microglia e altre popolazioni cellulari residenti nel SNC, tra cui oligodendrociti, neuroni e astrociti. Inoltre, microglia da diversi cervelli umani possono essere colturati per caratterizzazione di risposte immunitarie uniche per la medicina personalizzata e una miriade di applicazioni terapeutiche.
Introduction
Il sistema nervoso centrale (SNC) è costruito da una complessa rete di neuroni e cellule gliali1. Tra le cellule gliali, la microglia funziona come le cellule immunitarie innate del CNS2,3. Microglia sono responsabili del mantenimento dell’omeostasi nel sano CNS4. Microglia svolgono anche un ruolo importante nel neurosviluppo, potando le sinapsi2. Le microglia sono centrali nella fisiofisiologia di diverse malattie neurologiche, tra cui, ma non limitate; Morbo di Alzheimer5, Morbo di Parkinson6,ictus 7, sclerosi multipla8, lesione cerebrale traumatica9, dolore neuropatico10, lesione del midollo spinale11 e tumori cerebrali come gliomas12.
Gli studi relativi all’omeostasi e alle malattie del SNC utilizzano la microglia dei roditori a causa di una carenza di protocolli di isolamento primario di microglia umano13 efficientiin termini di costi ed efficienti in termini di tempo. I microglia roditori assomigliano alla microglia umana primaria nell’espressione di geni come Iba-1, PU.1, DAP12 e M-CSF recettori e sono stati efficaci nella comprensione del cervello normale emalore 13. È interessante notare che l’espressione di diversi geni immuni correlati come TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia tra microglia umana e roditore13. L’espressione di diversi geni varia anche nell’espressione temporale e nelle malattie neurodegenerative in entrambe lespecie 14,15. Queste differenze significative rendono la microglia umana un modello essenziale per studiare la funzione della microglia nell’omeostasi e nella malattia. La microglia umana primaria può anche essere uno strumento efficace per lo screening preclinico dei potenziali candidati ai farmaci16. Le ragioni di cui sopra sottolineano la crescente necessità di protocolli convenienti per l’isolamento della microglia umana primaria.
Abbiamo sviluppato un protocollo per l’isolamento della microglia umana primaria dal tessuto cerebrale umano adulto raccolto a seguito di una finestra chirurgica creata per le resezioni tumorali o altre resezioni chirurgiche. Il metodo in questo caso è notevolmente diverso dai metodi esistenti. Siamo stati in grado di isolare e coltura microglia dopo un tempo di transito di circa 75 minuti dal sito di raccolta dei tessuti per avviare il protocollo di isolamento in laboratorio. Abbiamo usato il supernatant di cellule fibroblasti L929 per promuovere la crescita di microglia isolata. Questo metodo si concentra specificamente sulla cultura e lo sviluppo di solo microglia primaria. La coltura risultante è di circa l’80% di microglia. Mentre altri protocolli forniscono una coltura arricchita di microglia per centrifugazione gradiente di densità, citometria di flusso e perline magnetiche, il protocollo è un modo rapido, semplice, robusto ed economico per coltura primaria microgliaumana 17,18,19,20. La capacità di utilizzare il tessuto cerebrale adulto vivo rimosso chirurgicamente invece di tessuti cerebrali fissi dai cadaveri dimostra un ulteriore vantaggio di questo metodo in contrasto con le procedureesistenti 18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia garantire l’omeostasi nel cervello normale e svolgere ruoli centrali nella fisiopatologia di varie malattie neurologiche4. I microglia sono centrali per il neurosviluppo e la formazione di sinapsi2. Gli studi microgliali si sono dimostrati fondamentali nella comprensione dello sviluppo e della progressione di diverse malattieneurologiche 4. La microglia roditore è il modello prevalente di scelta per gli studi primari sui microgliali, anche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il laboratorio di SJ è stato istituito con sovvenzioni istituzionali dell’IITJ ed è finanziato da sovvenzioni del Dipartimento di Biotecnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e del Ministero dell’Elettronica e della Tecnologia dell’Informazione dell’India (n. 4(16)/2019-ITEA). Le sezioni del tessuto cerebrale umano sono state ottenute dall’All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur dopo l’autorizzazione del comitato etico istituzionale. Ringraziamo Mayank Rathor, membro B.Tech Student della Design and Arts Society IIT Jodhpur, per il supporto alla videografia.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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