في تسجيل داخل الخلايا في الجسم من نوع تحديد الفئران موتونيورونات العمود الفقري خلال عبر العمود الفقري التحفيز المباشر للتيار
Summary
يصف هذا البروتوكول في التسجيل داخل الخلايا الجسمية للورذان القطنية مع التحفيز المباشر المباشر عبر العمود الفقري المتزامن. الطريقة تمكننا من قياس خصائص الغشاء وتسجيل اطلاق إيقاعي من ال motoneurons قبل وأثناء وبعد الاستقطاب anodal أو cathodal من الحبل الشوكي.
Abstract
التسجيل داخل الخلايا من موتونيورونات العمود الفقري في الجسم الحي يوفر “معيار الذهب” لتحديد الخصائص الكهربائية للخلايا في شبكة العمود الفقري سليمة ويحمل مزايا كبيرة بالنسبة لتقنيات التسجيل الكلاسيكية في المختبر أو خارج الخلية. ميزة في التسجيلات داخل الخلايا الحية هو أن هذه الطريقة يمكن أن تؤدي على الحيوانات البالغة مع نظام عصبي ناضجة تماما، وبالتالي يمكن ترجمة العديد من الآليات الفسيولوجية الملاحظة إلى تطبيقات عملية. في هذه الورقة المنهجية، نحن وصف هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع التحفيز المستمر التيار المطبق خارجيا، والذي يحاكي عمليات الاستقطاب التي تحدث داخل شبكات الخلايا العصبية الشوكية. التحفيز المباشر للتيار عبر العمود الفقري (tsDCS) هو طريقة مبتكرة تستخدم بشكل متزايد كتدخل عصبي في إعادة التأهيل بعد الإصابات العصبية المختلفة وكذلك في الرياضة. لا يزال تأثير tsDCS على الجهاز العصبي غير مفهوم بشكل جيد والآليات الفسيولوجية وراء أفعاله غير معروفة إلى حد كبير. تطبيق tsDCS في وقت واحد مع التسجيلات داخل الخلايا تمكننا من مراقبة مباشرة التغيرات في خصائص غشاء موتونيورون وخصائص اطلاق الايقاع ردا على استقطاب شبكة الخلايا العصبية الشوكية، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم الإجراءات tsDCS. وعلاوة على ذلك، عندما يتضمن البروتوكول المقدم تحديد التورون فيما يتعلق بالعضلات المُعَدَّة ووظيفتها (المرن مقابل التمدد) وكذلك النوع الفسيولوجي (سريع مقابل بطيء) فإنه يتيح فرصة للتحقيق بشكل انتقائي في تأثير tsDCS على مكونات محددة من دوائر العمود الفقري، والتي يبدو أنها تتأثر بشكل مختلف باستقطاب. ويركز الإجراء المقدم على الإعداد الجراحي للتسجيلات داخل الخلايا والتحفيز مع التركيز على الخطوات الضرورية لتحقيق استقرار الإعداد وقابلية تكرار النتائج. وتناقش تفاصيل منهجية تطبيق أنودال أو الكاثdal tsDCS مع إيلاء الاهتمام للقضايا العملية والسلامة.
Introduction
عبر العمود الفقري التحفيز الحالي المباشر (tsDCS) تكتسب الاعتراف كوسيلة قوية لتعديل استثارة الدائرة الشوكية في الصحة والمرض1,2,3. في هذه التقنية، يتم تمرير تيار ثابت بين القطب النشط الموجود فوق شرائح العمود الفقري المحددة، مع قطب مرجعي يقع إما ventrally أو أكثر من4. وقد أكدت العديد من الدراسات بالفعل أنه يمكن استخدام tsDCS في إدارة بعض الحالات المرضية، مثل الألم العصبي5، التشنج6، إصابة الحبل الشوكي7 أو لتسهيل إعادة التأهيل8. يقترح الباحثون أن tsDCS يثير التعديلات في التوزيع الأيوني بين الفضاء داخل الخلايا وخارج الخلية عبر غشاء الخلية ، وهذا يمكن أن يسهل أو يمنع نشاط الخلايا العصبية اعتمادا على التوجه الحالي9،10،11. ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، كان هناك نقص في تأكيد مباشر لهذا التأثير على الـ motoneurons.
هنا، ونحن وصف بروتوكول مفصل لإجراء في تسجيل داخل الخلايا الجسمية من الإمكانات الكهربائية من اللوبيرونات القطنية في الفئران المصبعر مع تطبيق متزامن من tsDCS، من أجل مراقبة التغيرات في غشاء موتونيورون وإطلاق خصائص استجابة لالانتحال الأنودال أو cathodal من شبكة الخلايا العصبية الشوكية. التسجيلات داخل الخلية فتح عدة مجالات للتحقيق في خصائص الخلايا العصبية, غير متوفرة لتقنيات خارج الخلية المستخدمة سابقا9,12. على سبيل المثال، من الممكن قياس استجابة الجهد الغشاء ال motoneuron بدقة إلى التدفق الحالي المباشر الناجم عن tsDCS، للإشارة إلى عتبة الجهد لتوليد ارتفاع، أو لتحليل المعلمات المحتملة العمل. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية تسمح لنا لتحديد خصائص الغشاء الخامل موتونورون، مثل المقاومة المدخلات، ومراقبة العلاقة بين تيار التحفيز داخل الخلايا وتواتر اطلاق الإيقاعي من موتونيورونات. تحديد مضاد للmotoneuron المسجلة، استنادا إلى تحفيز الأعصاب التي تم تحديدها وظيفيا (أي الأعصاب التي توفر الإفراسات إلى المرنات أو extensors) يسمح لنا بالإضافة إلى ذلك لتحديد أنواع من وحدات المحركات إيندفيديد (سريع مقابل بطيء)، مما يعطي فرصة لاختبار ما إذا كان الاستقطاب يؤثر بشكل مختلف العناصر الفردية من نظام العمود الفقري ناضجة. بسبب عملية جراحية واسعة النطاق تسبق التسجيل والمتطلبات العالية على استقرار وموثوقية التسجيلات ، هذه التقنية صعبة للغاية ولكنها تسمح بتقييم مباشر وطويل الأجل للخصائص الفسيولوجية الكهربائية ل motoneuron واحد: قبل وأثناء وبعد تطبيق tsDCS ، وهو أمر حاسم لتحديد كل من إجراءاتها الحادة والتأثيرات المستمرة13. كما motoneuron ينشط مباشرة ألياف العضلات خارج14 ويشارك في السيطرة على ردود الفعل من تقلص العضلات وتطوير قوة15،16 أي تأثير لوحظ من tsDCS على وحدة المحرك أو خصائص العضلات قد تكون مرتبطة بالتعديلات من الإثارة motoneuron أو إطلاق الخصائص.
Protocol
Representative Results
Discussion
إذا تم تنفيذها بشكل صحيح، يجب إكمال الجزء الجراحي من البروتوكول الموصوف في غضون ثلاث ساعات تقريبًا. وينبغي للمرء أن يأخذ عناية خاصة في الحفاظ على ظروف فسيولوجية مستقرة من أثناء الجراحة، ولا سيما درجة حرارة الجسم وعمق التخدير. وبصرف النظر عن الاعتبارات الأخلاقية الواضحة، يمكن أن يؤدي عدم ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل منحة المركز الوطني للعلوم رقم 2017/25/B/NZ7/00373. يود المؤلفون أن يعترفون بعمل حنا درزيمالا-سيليتشوسكا وويلودزيميرز مروثزينسكي، اللذين ساهما في جمع وتحليل البيانات للنتائج المقدمة في هذه الورقة.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. 신경과학. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).
