Implantação de stents coronários de tamanho humano na aorta abdominal de rato usando um acesso trans-femoral
Summary
Este protocolo descreve a implantação de stents coronários humanos na aorta abdominal de ratos com um apoE-/- fundo usando um acesso trans-femoral. Em comparação com outros modelos animais, os modelos murinos carregam as vantagens da alta produtividade, reprodutibilidade, facilidade de manuseio e habitação, e uma ampla disponibilidade de marcadores moleculares.
Abstract
A intervenção coronária percutânea (ICI), combinada com a implantação de um stent coronário, representa o padrão-ouro no tratamento intervencionista da doença arterial coronariana. A restenose in-stent (ISR) é determinada por uma proliferação excessiva do tecido neointimal dentro do stent e limita o sucesso a longo prazo dos stents. Uma variedade de modelos animais têm sido usados para elucidar processos fisiopatológicos subjacentes à restenose de stent (ISR), sendo o coronário suíno e os modelos de artéria ilíaca de coelho sendo os mais utilizados. Os modelos murinos oferecem as vantagens de alta produtividade, facilidade de manuseio e habitação, reprodutibilidade e ampla disponibilidade de marcadores moleculares. O modelo de camundongos deficientes apolipoprotein E (apoE-/- ) tem sido amplamente utilizado para estudar doenças cardiovasculares. No entanto, os stents devem ser miniaturizados para serem implantados em camundongos, envolvendo mudanças importantes de suas propriedades mecânicas e (potencialmente) biológicas. O uso de apoE-/- ratos podem superar essas deficiências como apoE-/- ratos permitem a avaliação de stents coronários de tamanho humano e, ao mesmo tempo, fornecendo um fenótipo aterogênico. Isso faz deles um modelo excelente e confiável para investigar isr após a implantação do stent. Aqui, descrevemos, em detalhes, a implantação de stents coronários humanos comercialmente disponíveis na aorta abdominal de ratos com um apoE-/- fundo usando um acesso trans-femoral.
Introduction
A intervenção coronária percutânea (ICI), combinada com a implantação de um stent coronário, representa o padrão-ouro no tratamento intervencionista da doença arterial coronariana1. O sucesso a longo prazo dos stents, no entanto, pode ser limitado pela ocorrência de restenose in-stent (ISR) que é determinada por uma proliferação excessiva de tecido neointimal dentro do stent2,3. O ISR pode exigir uma nova intervenção com bypass da artéria coronária ou re-PCI. Uma variedade de modelos animais foram sugeridos para o estudo do ISR, cada um deles apresentando vantagens e deficiências. As principais desvantagens dos modelos de artérias ilíacas suínos mais utilizados e coelhinhos, embora desenvolvendo lesões marcadamente semelhantes aos humanos após a implantação do stent4,5, são grandes custos de animais e habitação que trazem dificuldades logísticas especialmente em estudos de longo prazo, bem como limitações no manuseio e equipamentos. Além disso, a disponibilidade de anticorpos para proteínas celulares de suínos e coelhos é limitada. Por outro lado, os modelos murine proporcionam as principais vantagens do alto rendimento e reprodutibilidade, bem como a facilidade de manuseio, moradia e, portanto, custo-efetividade. Além disso, um maior número de anticorpos estão disponíveis. No entanto, enquanto os camundongos deficientes e-deficientes de apolipoproteína (apoE-/-) camundongos têm sido amplamente utilizados para o estudo da aterosclerose6,7,8, eles são inadequados para o estudo do ISR, pois os stents devem ser miniaturizados para serem implantados em camundongos, potencialmente mudando as propriedades mecânicas dos stents. Além disso, a parede aórtica de camundongos mede entre 50 μm em camundongos jovens e 85 μm em camundongos antigos9, e os stents devem ser implantados usando níveis de pressão tão baixos quanto 2 atm, o que pode levar à malapposição do stent10. Os ratos, no entanto, permitem a implantação de stents coronários humanos disponíveis comercialmente, e demonstram um curso de cura vascular semelhante a animais maiores após a implantação do stent aórtico, relatado pela primeira vez por Langeveld et al.11. Esta técnica originalmente exigia um acesso trans-abdominal, o que exigia uma constrição física da aorta para conseguir uma interrupção temporária do fluxo sanguíneo. Para evitar a lesão potencialmente associada do vaso e reações inflamatórias, a técnica foi posteriormente refinada pela introdução de um acesso transilílico, o que resultou, além disso, em uma maior taxa de sobrevivência dos animais12.
Como ratos de tipo selvagem não desenvolvem lesões ateroscleróticas13, apoE-/- ratos foram gerados usando técnicas de nuclease como Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regularmente Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15, e Zinc Finger (ZF)16. ApoE-/- ratos estão disponíveis comercialmente desde 2011. Fornecendo um fundo atherogênico, os ratos apoEpermitem uma avaliação mais realista dos stents coronários do tamanho humano, especialmente no que diz respeito ao ISR.
Aqui, descrevemos o método através da rota de acesso transfemoral e usando um stent de eluição de drogas de cobalto-cromo (DES) comercialmente disponível, no entanto, também pode ser aplicado para o estudo de outros tipos de stent, como stents metálicos nus (BMS) ou stents biodegradáveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a implantação de stents coronários de tamanho humano na aorta abdominal de apoE-/- ratos. Vários pontos técnicos merecem ser enfatizados. Primeiro, deve ser evitada uma incompatibilidade entre o tamanho do stent e o tamanho da aorta. Colocar um stent muito pequeno pode levar à malapa do stent, enquanto a implantação de um stent muito grande para a aorta pode causar excesso de alongamento, rasgos e ferimentos do vaso. Por isso, recomendamos o uso de stents entre 2,0 e 2,5 mm de d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Sra. Angela Freund por sua inestimável assistência técnica com a incorporação e produção de slides. Também gostaríamos de agradecer ao Sr. Tadeusz Stopinski no Instituto de Ciência Animal & Cirurgia Experimental do Instituto de Ciência Animal & Experimental por sua ajuda perspicaz com o trabalho veterinário.
Materials
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
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