DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류 세포는 화학 물질, 방사선 및 자연적으로 발생하는 신진 대사 부산물, DNA 모욕의 특정 유형을 생성합니다. 독독성 제는 DNA 백본을 손상시키거나, 부러뜨리거나, 개별 기지의 화학적 특성을 수정할 수 있습니다. DNA 모욕에 따라 DNA 손상 반응(DDR) 경로가 활성화되고 수리에 관련된 단백질이 채용됩니다. 손상 유형을 감지하고 적절한 수리 응답을 활성화하는 데 많은 요인이 관여합니다. DDR 요인을 올바르게 활성화하고 모집하지 못하면 유전체 불안정으로 이어질 수 있으며 암을 포함한 많은 인간의 병리학에 기초가 됩니다. DDR 단백질의 연구는 약물 내성의 물질독성 약물 반응 과 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
생체 내에서단백질을 시각화하는 두 가지 주요 방법이 있습니다 : 직접 관찰, 형광 단백질로 관심있는 단백질을 태그하고 라이브 이미징에 의해 다음, 또는 고정 된 샘플에 간접 적인 면역 형광. 형광 태그 단백질의 시각화는 시간이 지남에 따라 정밀한 모니터링을 허용하지만, N-또는 C 종면에서 직접 태그는 단백질 국소화 또는 기능을 방해할 수 있습니다. 수정되지 않은 내생성 버전에서 단백질을 관찰하는 것이 바람직합니다. DNA 복구 단백질이 DNA 모욕에 모집될 때, 그들의 농도는 현지에서 증가하고 특정 항체를 사용하여 간접적인 면역 형광에 의해 가시화될 수 있는 그룹, 또는 "foci"를 형성합니다.
단백질 foci의 검출은 직접적인 상호 작용의 확실한 증거를 제공하지 않지만, 세포에 있는 단백질의 공동 현지화는 손상의 사이트에 다시 그룹화하고 복잡한 형성을 위해 요구되는 사건의 순서를 알릴 수 있다는 것을 나타냅니다. 단백질의 야생 모형 또는 돌연변이 버전을 표현하는 세포에 있는 foci 공간 중첩의 주의깊은 분석은 DNA 복구 기능에 중요한 기능적인 도메인에 귀중한 단서를 제공할 수 있습니다. 마지막으로, 단백질의 공동 국소화는 세포의 공동 면역 침전성 또는 정제 된 단백질을 사용하여 직접 풀다운하여 검증 될 수있는 가능한 직접적인 상호 작용을 나타냅니다.
서론
인간 세포는 다양한 기원의 다양한 DNA 손상 제에 지속적으로 노출됩니다. 외인성 근원은 주로 방사선, 화학물질 (화학요법 에이전트 및 몇몇 항생제를 포함하여), 바이러스에 노출로 이루어져 있고, 주요 내인성 근원은 DNA 복제 및 산화 긴장에 있는 오류를 포함하는 동안. 물질독성 노출의 직접적인 영향은 응력과 노출 량에 따라 변형된 베이스에서 잠재적으로 치명적인 DNA 이중 가닥 브레이크(DSB)까지 다양할 수 있습니다. 궁극적으로, 수리되지 않거나 잘못 수리된 DNA 손상은 돌연변이, 게놈 재배치, 게놈 불안정의 축적으로 이어질 수 있고 결국 발암발생 1으로이어질 수 있다. 포유류 세포는 DNA손상2,,3의 특정 유형을 인식하고 세포 주기 진행과 동기화된 적시 방식으로 복구하기 위해 복잡한 경로를 진화시켰다.
이온화 방사선 (IR)은 DNA 이중 나선을 손상시키고 DNA 손상의 가장 해로운 형태 중 하나 인 이중 가닥 휴식 (DSBs)을 만듭니다. MRN(MRE11, RAD50, NBS1) 복합기능은 DNA의 센서로서 기능하며 단백질 키나제 실조(ATM)4,
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프로토콜
1. HeLa 세포 배양
- 16-18 시간 동안 50 °C에서 1 M HCl로 둥근 유리 커버립을 사전 처리하십시오. ddH2O로 헹구고 100 % EtOH에 보관하십시오.
- 세포 배양 배지 준비: DMEM 배지에 10%(v/v) FBS를 추가합니다.
- 멸균 12웰 플레이트에서 4.0 x 104 셀/잘 성장하여 가습된 인큐베이터에서 18mm 원형 유리 커버슬립과 5% CO2를 제공합니다. 세포를 80%의 합류(약 24시간)로 증가시다.
2. 방사선을 가진 세포 처리 (IR)
- 이중 가닥 파손의 형성을 유도하기 위해 세포를 4 Gy γ-조사(대조군: 조사 없음, t=0)에 노출시킵니다. 감마셀-40에서는 분당 0.815Gy에서 4.54분에 해당합니다.
- 적절한 시간 길이에 대한 가습 된 인큐베이터에서 37 °C 및 5 % CO2에서 세포를 배양하십시오 (여기서 선택된 시간 점은 t = 1, 2, 4, 16 h).
3. 핵 추출 및 세포 고정
- 재고 솔루션 준비: 0.2 M PIPES (pH 6.8), ....
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결과
2일째, 또는 24h 포스트 시드 세포에 커버립, 세포는 한 분열을 겪고 80% 컨실수있습니다. DNA 수리 단백질의 특정 노크 다운 또는 돌연변이는 두 배의 시간을 증가시킬 수 있으며, 유전 독성 치료에 세포를 민감하게 할 수 있으며, 종자 밀도뿐만 아니라 치료 용량도 그에 따라 조정되어야 한다. 최상의 작업 조건을 결정하기 위해, DNA 손상 반응의 타이밍은 시간이 지남에 따라 γH2AX의 서양 블로팅에 의해 확립될 수 있고, 조사에 대한 민감도는 식민지 형성 분석에 의해 식별될 수 있다.
조사로 처리되지 않은 세포는 거의, 있는 경우, γH2AX 포시(도3A)를나타낸다. 그러나, γH2AX 포시 형성은 성장하는 조건에 내재된 각종 응력에 의해 배양된 세포에서 시작될 수 있다: 산성화 된 매체에 컨실루를 남긴 세포, FBS에 있는 물질독성 내독소의 존재, 문화에 사용되는 산소 농도, 몇몇을 인용하기 위하여.
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토론
현미경 검사법에 의한 DNA 손상 수리의 타이밍 그리고 효율의 분석은 DNA 복구 기계가 일반적인 세포 및 암과 같은 인간 병리에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 필수적임이 입증되었습니다.
인계판에서 활성단백질을 검출할 수 있는 특정 항체의 개발(예: γH2AX, pRPA, pRAD50 등10,,23,,39,,43)사건의 DNA 수리 타이밍과 세포 주기와의 동기화를 더 잘 이해하는 데 중심적인 역할을 해왔다. 이러한 성공은 질량 분석 및 면역 국소화(검토를 위한32참조)에 의해 53BP1 인산 잔류물의 분석에 의해 예시되며, 이는 이 무겁게 변형된 단백질의 기능을 이해하는 데 도움이 되었다. STORM과 같은 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 샌안토니오 지역 재단의 보조금에 의해 지원되었다. 메이스 암 센터는 NCI 암 센터 지원 코어 보조금 P30 CA054174에 의해 지원됩니다. 시약을 조달하는 데 도움을 준 스티븐 할로웨이와 우주 및 현미경 용량 제공에 대한 성 연구소에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 16%(v/v) 파라포름알데히드(PFA) 수용액 | 전자 현미경 Sciences | 15710 | PFA의 현미경 검사 품질은 최상의 이미지를 보장합니다. "집에서 만든 PFA"를 사용하는 경우 사용하기 전에 필터링하십시오. |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | A3059 | 열 충격 분율은 강수/배경을 피하기 위해 권장됩니다. |
| 커버글라스 #1, 18mm 라운드(커버슬립) | Neuvitro | NC0308920 | 커버슬립은 HCl 또는 에탄올과 함께 사용하기 전에 세척 및 멸균해야 합니다. |
| DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] | Gibco | 11965118 | 사용되는 세포주의 필요에 따라 성장 배지를 조정합니다. |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Gibco | 14190144 | PBS. |
| 에틸렌 글리콜 -비스 (β - 아미노 에틸 에테르) -N, N, N&prime, N ′ - 테트라 아세트산 (EGTA) | Research Products International | E57060 | 핵 추출 버퍼. |
| 소 태아 혈청(FBS) | Life Technologies | 104370028 | FBS의 품질은 gH2AX 병소 형성을 테스트하여 평가할 수 있습니다. 배치에 미량의 유전독성 내독소가 존재하는 경우 gH2AX는 스트레스가 없을 때 양성입니다. |
| 염화마그네슘(MgCl2) | Research Products International | M24000 | 핵 추출 버퍼. |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Products International | P40150 | 핵 추출 버퍼. |
| Invitrogen | S36973 | 포함된 SlowFade Diamond Antifade Mountant | 300nM DAPI(VECTASHIELD Antifade Mounting Medium)를 대신 사용할 수 있습니다. |
| 염화나트륨(NaCl) | Research Products International | S23020 | 핵 추출 버퍼. |
| Sucrose | Research Products International | S24060 | 핵 추출 버퍼. |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisherbrand | 1255015 | 폴리신 슬라이드를 대신 사용할 수 있습니다. |
| TC 처리 된 다중 웰 플레이트, 크기 12 웰 | Costar | 3513 | 커버 슬립에 파종은 12 웰 플레이트에서 수행됩니다. |
| Triton X-100 | AmericanBio | AB02025 | 핵 추출 버퍼. |
| TrypLE Express Enzyme (1X), 페놀 없음 Red | Gibco | 12604021 | Trypsin-EDTA를 대신 사용할 수 있습니다. |
| Trypsin-EDTA (0.5%), 페놀 없음 Red | Gibco | 15400054 | TrypLE를 대신 사용할 수 있습니다. |
참고문헌
- Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).
- Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N.
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재인쇄 및 허가
