Détection de l’ADN sans cellules dans les échantillons de plasma sanguin des patients atteints de cancer

Summary

Dans cet article nous présentons un protocole détaillé pour la technique non invasive de biopsie liquide, y compris la collecte de sang, la séparation de manteau de plasma et de buffy, l’extraction de cfDNA et d’ADN de germline, la quantification de cfDNA ou d’ADN de germline, et l’analyse d’enrichissement de fragment de cfDNA.

Abstract

L’identification des mutations dans les tumeurs des patients cancéraux est une étape très importante dans la gestion de la maladie. Ces mutations servent de biomarqueurs pour le diagnostic tumoral ainsi que pour la sélection du traitement et sa réponse chez les patients atteints de cancer. La méthode actuelle d’étalon-or pour détecter des mutations de tumeur implique un essai génétique de l’ADN de tumeur au moyen des biopsies de tumeur. Cependant, cette méthode envahissante est difficile à effectuer à plusieurs reprises comme essai de suivi du répertoire mutationnel de tumeur. La biopsie liquide est une technique nouvelle et émergente pour détecter les mutations tumorales comme approche de biopsie facile à utiliser et non invasive.

Les cellules cancéreuses se multiplient rapidement. En parallèle, de nombreuses cellules cancéreuses subissent une apoptose. Les débris de ces cellules sont libérés dans le système circulatoire d’un patient, ainsi que des morceaux d’ADN finement fragmentés, appelés fragments d’ADN sans cellules (CFDNA), qui portent des mutations de l’ADN tumoral. Par conséquent, pour identifier les biomarqueurs basés sur cfDNA utilisant la technique liquide de biopsie, des échantillons de sang sont rassemblés des patients cancéraux, suivis de la séparation du plasma et du manteau buffy. Ensuite, le plasma est traité pour l’isolement de cfDNA, et la couche buffy respective est traitée pour l’isolement de l’ADN génomique d’un patient. Les deux échantillons d’acide nucléique sont ensuite vérifiés pour leur quantité et leur qualité; et analysé pour les mutations à l’aide de techniques de séquençage de prochaine génération (NGS).

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé pour la biopsie liquide, y compris la collecte de sang, le plasma, et la séparation buffy de manteau, l’extraction de cfDNA et d’ADN de germline, la quantification de cfDNA ou d’ADN de germline, et l’analyse d’enrichissement de fragment de cfDNA.

Introduction

Les progrès technologiques ont conduit au séquençage de centaines de génomes de cancer et transcriptomes¹. Cela a contribué à comprendre les paysages des changements moléculaires entre les différents types de cancer². D’autres études sur ces paysages ont contribué à caractériser les altérations somatiques séquentielles et les fusions^{gène-gène 3} qui sont impliquées dans le cancer ou la progression tumorale, en perturbant périodiquement les voies d’apoptose⁴. Par conséquent, les mutations somatiques et les fusions gène-gène peuvent fournir l’information au sujet des tumeurs en servant de biomarqueurs dans les patients individuels pour un type particulier de tumeur^5,identifiant le pronostic primaire existant de tumeurs^6,catégorisant des tumeurs secondaires basées sur des changements moléculaires^7,et identifiant des cibles de tumeur druggable^8. Ces informations peuvent faciliter la sélection d’un traitement personnalisé pour les patients atteints de cancer et dans la détermination des réponses positives et négatives au^{traitement 9}. Cependant, obtenir le matériel de tumeur pour identifier le profilage génomique du tissu de tumeur est une procédure^{envahissante 10.} En outre, une biopsie de tumeur comprend seulement une petite partie d’une tumeur hétérogène ; et peut, par conséquent, ne pas être représentatif pour le profil moléculaire de la tumeur entière¹¹. La surveillance périodique et le génotypage de tumeur exigent une collection répétée des tissus de tumeur, qui, habituellement, n’est pas faisable en raison de l’invasivité de la procédure de biopsie de tumeur et des issues de sûreté qui découlent de telles procédures^12.

La technique de biopsie liquide, d’autre part, a gagné l’attention énorme dans l’oncologie de précision au cours de^{la dernière décennie 13,14}. Elle est principalement due à la non-invasiveness de cette technique, et à la possibilité qu’elle soit répétée à plusieurs moments, permettant ainsi une technique de surveillance facile à utiliser et sûre pour les cours^{de la maladie 15,16}. La biopsie liquide est basée sur un phénomène que les cellules tumorales se multiplient rapidement, et simultanément beaucoup d’entre elles subissent l’apoptose et la nécrose. Ceci mène à la libération des débris apoptotiques de cellules dans le sang des patients, avec les fragments d’ADN qui sont coupés à des tailles précises pendant l’apoptose^17. L’apoptose des cellules non cancéreuses conduit également à la libération de ses débris cellulaires dans le sang, cependant, le taux d’apoptose dans ces cellules est relativement beaucoup plus faible que les cellules tumorales¹⁸. Le rationnel de la technique de biopsie liquide est de capturer les molécules tumeur-associées telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, et les cellules de tumeur^14,19 qui circulent continuellement dans le sang. Diverses techniques^{20 peuvent} être utilisées pour l’analyse de ces molécules, y compris le séquençage de prochaine génération (NGS), la réaction en chaîne de polymése de gouttelette numérique (DdPCR), le PCR en temps réel et l’essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA). La technique de biopsie liquide permet d’identifier les biomarqueurs qui sont des caractéristiques des cellules tumorales. Ces molécules de biomarqueur ne sont pas seulement libérées des parties spécifiques d’une tumeur, mais plutôt de toutes les parties de la^{tumeur 21.} Par conséquent, les marqueurs identifiés dans la biopsie liquide représente le profilage moléculaire d’une tumeur hétérogène entière, en plus d’autres tumeurs dans le corps, ayant ainsi des avantages au-dessus de la technique basée sur la biopsie de tissu^22.

Le cfDNA a une courte demi-vie dans le sang circulant allant de quelques minutes à 1-2 heures²³. Cependant, le temps court de demi-vie de cfDNA facilite des analyses en temps réel en évaluant la réponse de traitement et les évaluations dynamiques de tumeur. Les niveaux de cfDNA tumeur-dérivés indiquent le pronostic du stade/taille de tumeur démontré par plusieurs études, qui ont montré une relation entre des niveaux de cfDNA et les résultats de survie^24. En outre, les études ont prouvé que le cfDNA a une meilleure capacité de prévision que les marqueurs de tumeur existants^25. Le pronostic de cfDNA est encore plus prononcé après traitement de cancer, les niveaux plus élevés de cfDNA suivant le traitement corrélé bien avec un taux réduit de survie, et la résistance au traitement. Attendu que les niveaux inférieurs de cfDNA suivant la thérapie correspondent généralement à la réponse positive de traitement. En outre, l’ADNfc facilite la détection précoce de la réponse au traitement que les méthodes de détection traditionnelles.

Le cfDNA augmente la possibilité de détection précoce des mutations associées au cancer : pendant la maladie à un stade^{précoce 15,}l’apparition des symptômes²⁶ et avant le diagnostic du cancer jusqu’à 2^{ans 27}. Comme cfDNA est libéré de plusieurs régions tumorales ou foyers, son analyse fournit une vue complète du génome tumoral qu’il représente²⁸. Par conséquent, le cfDNA permet de détecter des mutations somatiques qui auraient pu être manquées dans les échantillons de tissu^29. Comme l’hétérogénéité intra-tumorale et les mutations subclonales peuvent être détectées par séquençage profond des régions génomiques couvrant des milliers de bases, d’où l’analyse de la CFDNA permet de découvrir des sous-types moléculaires spécifiques avec des signatures génomiques distinctes¹³. Pour obtenir un niveau similaire d’information par l’échantillon de tissu beaucoup de biopsies pleines aurait été nécessaire.

En outre, les niveaux de cfDNA dans les patients présentant une maladie localisée telle que le cancer du côlon, de l’ovaire, et du poumon après un traitement chirurgical et/ou une chimiothérapie, ont démontré pour être un marqueur pronostique puissant pour la répétition de cancer et les résultats de^{traitement 20.} En outre, dans les patients présentant le cancer du côlon, du sein, et du poumon, les analyses de cfDNA du sang pourraient avec succès détecter les changements tumeur-spécifiques, qui ont mené à la prévision précise de répétition plusieurs mois à^{l’avance 13.} En outre, les marqueurs de résistance au traitement, tels que les mutations KRAS chez les patients atteints de CRC recevant une thérapie anti-EGFR³⁰; VAFs pour des gènes tels que PIK3CA, MED1 ou EGFR chez les patients atteints de cancer du sein après le traitement avec diverses thérapies³¹; et la mutation de résistance d’EGFR T790M dans les patients de cancer du poumon traités avec EGFR-ciblés TKIs³² peut également être identifiée par l’analyse de cfDNA.

En résumé, l’analyse cfDNA peut être utilisée pour identifier des biomarqueurs précis dans le domaine de l’oncologie^13,33. Dans ce protocole, des échantillons de sang de 3 patients de glioma et de 3 contrôles sains ont été traités pour obtenir l’ADN génomique des WBCs et cfDNA du plasma. Dans le cancer de gliome, les mutations dans IDH, TERT, ATRX, EGFR, et TP53 sert de marqueurs diagnostiques aussi bien que pronostiques qui peuvent aider dans le diagnostic tôt des tumeurs de glioma, classant différents types de tumeurs de glioma, guidant le traitement précis pour le patient individuel et comprenant la réponse^{de traitement 34,35.} L’état mutationnel de ces gènes peut être identifié à l’aide de cfDNA dérivé du sang. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé de cfDNA plasma-dérivé qui a été employé pour étudier des changements mutationnels dans le cancer de gliome^12. Un tel protocole de biopsie liquide basé sur cfDNA expliqué dans cet article peut être employé pour étudier des changements mutationnels dans beaucoup d’autres types de cancers. En outre, une étude récente a montré que la biopsie liquide à base de cfDNA peut détecter 50 différents types de cancers³⁶.

La collecte, l’entreposage et l’expédition d’échantillons de sang sont des étapes cruciales de ce protocole, car la température incontrôlée pendant ces étapes provoque la lyse desWBCs, conduisant à la libération de l’ADN génomique du WBC dans le plasma et causant la contamination de l’échantillon cfDNA, qui affecte le reste de la^{procédure 37}. L’hémolyse due à une température incontrôlée peut nuire aux processus de préparation de l’échantillon en aval de cfDNA, tels que les étapes^{PCR 38}. Le sérum contient une proportion élevée de germline cfDNA plutôt que de plasma, bien qu’il présente un grand bruit de fond pour cfDNA^{39 tumeur-associé.} Par conséquent, pour isoler cfDNA tumeur-associée, le plasma est un échantillon approprié^39. Le sang prélevé dans un tube anticoagulant contenant du sang doit être centrifugé immédiatement ou dans un délai de deux heures, afin de séparer le plasma et d’éviter la contamination par l’ADNfc. Dans ce protocole, des tubes commerciaux dédiés de collecte de sang de conservation de cfDNA sont employés (voir tableau des matériaux),qui sont une alternative à l’anticoagulant contenant des tubes de collecte de sang. Ces tubes dédiés à la collecte de sang préservent l’ADNfc et l’ARNfc, et empêchent la lyse des CCB jusqu’à 30 jours à température ambiante, et jusqu’à 8 jours à 37 °C. Cela facilite le maintien de la température appropriée lors d’une expédition d’échantillons de sang et jusqu’à ce que le plasma et wbc sont^{séparés 40}.

Il existe actuellement trois types de méthodologies d’extraction cfDNA : l’isolement de phase, la colonne de spin à base de membrane de silicium et l’isolement magnétique à base^{de perles 41}. La méthode de colonne de spin à base de silicium-membrane a donné une grande quantité de cfDNA avec l’intégrité élevée comparée à d’autres méthodes d’extraction de cfDNA^42.

L’évaluation quantitative de l’ADN est une exigence fondamentale dans la biopsie liquide, il est nécessaire de développer une procédure simple, abordable et standardisée pour leur mise en œuvre facile et leur utilisation à grande échelle. Trois méthodes couramment utilisées pour la quantification de cfDNA sont spectrophotométriques, fluorimétriques, et qPCR. La méthode fluorimétrique s’avère meilleure que les autres méthodes concernant l’exactitude, le coût et la facilité de conducttion⁴³.

L’intégrité et la pureté de la cfDNA peuvent être estimées soit par électrophoresis agarose ou électrophoresis capillaire. L’électrophoresis d’Agarose ne montre ni sensibilité à la faible concentration de cfDNA ni à haute résolution pour montrer la taille précise de fragment de cfDNA. D’autre part, l’électrophorèse capillaire a un avantage sur l’électrophoresis agarose en surmontant les défis associés et, par conséquent, largement utilisé par les chercheurs pour l’analyse de la taille des fragments cfDNA. Dans ce protocole, la distribution de la taille des fragments de cfDNA isolé a été estimée à l’aide d’un instrument automatisé d’électrophoresis capillaire (voir tableau des matériaux).

Protocol

Avant la collecte de sang, le consentement éclairé des sujets participant à la recherche est nécessaire et doit être obtenu. Les recherches décrites dans ce manuscrit ont été effectuées conformément au Rabin Medical Center, au Comité éthique d’Israël (code éthique: 0039-17-RMC) et à la Faculté de médecine Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Comité éthique allemand (code éthique: D 405/14). 1. Collecte et stockage d’échantillons de sang dans des tubes de conserv…

Representative Results

Séparation plasmatiqueLe sang de 8,5-9 mL recueilli dans les tubes de conservation cfDNA ou cfRNA donne environ ~4 mL de plasma en volume. Le volume de plasma séparé du sang recueilli dans les tubes EDTA peut varier en fonction de la température. L’exposition de tubes EDTA contenant du sang à une température supérieure à 37 °C entraîne une diminution du volume plasmatiquede rendement 44. Résultats de l’analyse fluoromètre</st…

Discussion

La collecte du sang d’un patient dans un tube, l’expédition et le stockage sont des étapes initiales cruciales dans la biopsie liquide. Une mauvaise manipulation peut nuire à la qualité du plasma et, par conséquent, peut interférer avec les résultats de la biopsie liquide⁴⁷. Si un échantillon de sang est prélevé dans un tube sanguin EDTA, le plasma doit être séparé dans les deux heures suivant la collecte de sang afin d’éviter la lyse des CWB et la libération de son ADN génom…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C