암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Summary

이 논문에서 우리는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 비 침습적 액체 생검 기술에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

암 환자의 종양에 있는 돌연변이를 확인하는 것은 질병 관리에 있는 아주 중요한 단계입니다. 이 돌연변이는 암 환자에 있는 처리 선택 그리고 그것의 반응을 위한 종양 진단을 위한 biomarkers 역할을 합니다. 종양 돌연변이를 검출하기 위한 현재 금 표준 방법은 종양 생검을 통해 종양 DNA의 유전 시험을 관련시킵니다. 그러나, 이러한 침습적 방법은 종양 돌연변이 레퍼토리의 후속 시험으로서 반복적으로 수행되기 어렵다. 액체 생검은 사용하기 쉽고 비 침습적 생검 접근법으로 종양 돌연변이를 검출하기위한 새롭고 새로운 기술입니다.

암세포는 급속하게 번식합니다. 동시에, 수많은 암세포는 세포멸을 겪습니다. 이 세포에서 파편은 종양 DNA 돌연변이를 전송하는 세포 없는 DNA (cfDNA) 단편에게 불린 섬세하게 단편화된 DNA 조각과 더불어 환자의 순환 계통으로 풀어 놓입니다. 따라서 액체 생검 기술을 사용하여 cfDNA 기반 바이오마커를 식별하기 위해 혈액 샘플을 암 환자로부터 수집하고 혈장 및 버피 코트의 분리가 뒤따릅니다. 다음으로, 혈장은 cfDNA의 분리를 위해 처리되고, 각각의 버피 코트는 환자의 게놈 DNA의 분리를 위해 처리된다. 두 핵산 샘플은 그 때 그들의 양과 질을 위해 검사됩니다; 차세대 염기서열분석(NGS) 기술을 이용한 돌연변이를 분석하였다.

이 원고에서는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 액체 생검에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Introduction

기술 발전은 암 게놈 과 전사^1의수백의 순서로 이끌어 냈습니다. 이것은 다른 암 모형^2에걸쳐 분자 변경의 풍경을 이해하는 데 기여했습니다. 이러한 경관에 대한 추가 연구는 암 또는 종양 진행에 관여하는 순차적인 체세포 변경 및 유전자 유전자 융합^3을 특징으로 하는 데 도움이 되었으며, 세포멸 경로^4를연속적으로 방해함으로써. 따라서, 체세포 돌연변이 및 유전자-유전자 융합은 특정 종양 유형^5에대한 개별 환자에서 바이오마커로 봉사하여 종양에 대한 정보를 제공할 수 있고, 기존의 1차 종양 예후^6을식별하고, 분자^변화에기초하여 이차 종양을 분류하고, 약물 종양^표적8을식별한다. 이러한 정보는 암 환자를 위한 개인화된 치료를 선택하고 양성 및 음성 치료 반응을 결정하는 데 용이하게 할 수 있습니다^9. 그러나, 종양 조직의 유전체 프로파일링을 식별하기 위한 종양 물질을 얻는 것은 침습적^{절차(10)이다.} 더욱이, 종양 생검은 이질성 종양의 작은 부분만을 포함합니다; 따라서 전체^{종양(11)의}분자 프로파일을 대표하지 않을 수 있다. 연쇄 모니터링 및 종양 지장화는 종양 조직의 반복된 수집을 필요로 하며, 이는 일반적으로 종양 생검 절차의 침습성 및 이러한 절차로부터 발생하는 안전 문제로 인해 실현 가능하지^않다(12).

반면에 액체 생검 기술은 지난 10년 동안 정밀 종양학에서^13,14로엄청난 주목을 받고 있습니다. 주로 이 기술의 비침습성, 그리고 여러 시간 지점에서 반복될 가능성으로 인해 질병^{과정(15,16)에}대한 사용하기 쉽고 안전한 모니터링 기술을 가능하게 한다. 액체 생검은 종양 세포가 급속하게 증식하는 현상에 근거하고, 동시에 그들 중 많은 사람들이 세포증과 괴사를 겪는다. 이것은 apoptosis¹⁷도중 정확한 크기로 절단되는 DNA 파편과 더불어 환자의 혈액으로 세포 파편의 방출로 이끌어 냅니다. 비암 세포의 세포 이물질의 방출은 또한 혈액으로 의 세포 파편의 방출로 이끌어 내고, 그러나, 이 세포에 있는 세포 세포 비율은 종양 세포¹⁸보다는 상대적으로 훨씬 낮습니다. 액체 생검 기술의 합리적은 혈액에서 지속적으로 순환하는 DNA, RNA, 단백질 및 종양 세포^14,19와 같은 종양 관련 분자를 포착하는 것입니다. 다양한^{기술(20)은} 차세대 시퀀싱(NGS), 디지털 물방울 폴리머라제 연쇄 반응(ddPCR), 실시간 PCR 및 효소-연결된 면역조산 분석(ELISA)을 포함하는 이들 분자의 분석에 사용될 수 있다. 액체 생검 기술은 종양 세포의 특징인 바이오마커를 식별할 수 있게 합니다. 이러한 바이오마커 분자는 종양의 특정 부위에서 방출되는 것이 아니라^{종양(21)의}모든 부분에서 방출된다. 따라서, 액체 생검에서 확인된 마커는 전체 이질성 종양의 분자 프로파일링을 나타내며, 신체의 다른 종양 이외에, 따라서 조직 생검 기반^{기술(22)에}비해 이점을 갖는다.

cfDNA는 몇 분에서 1-2 시간^23에이르는 순환 혈액에서 짧은 반감기 시간을 가지고 있습니다. 그러나 cfDNA의 짧은 반감기 시간은 치료 반응 및 동적 종양 평가를 평가하여 실시간 분석을 용이하게합니다. 종양 유래 cfDNA 수준은 cfDNA 수준과 생존 결과²⁴사이의 관계를 보여 준 여러 연구에 의해 입증 된 종양 단계 / 크기의 예후를 나타냅니다. 더욱이, 연구 결과는 cfDNA가 기존 종양 마커^25보다는더 나은 예측 능력을 가지고 있다는 것을 증명했습니다. cfDNA의 예후는 암 치료 후에 더욱 두드러지며, 치료 후 cfDNA의 높은 수준은 생존율이 감소되고 치료에 대한 저항과 잘 관련이 있습니다. 반면, cfDNA 다음 치료법의 낮은 수준은 일반적으로 양성 치료 반응에 해당합니다. 또한 cfDNA는 기존의 검출 방법보다 치료 반응의 조기 검출을 용이하게 합니다.

cfDNA는 암 관련 돌연변이의 조기 발견 가능성을 증가시킵니다: 초기 단계 질병¹⁵도중, 현상의 개시²⁶ 및 2 년 까지 암 진단 의 앞에^{2년 27까지.} cfDNA는 다중 종양 영역 또는 초점으로부터 방출되기 때문에, 그 분석은^28을나타내는 종양 게놈의 포괄적인 보기를 제공한다. 따라서, cfDNA는 조직 견본^29에서놓쳤을 지도 모르다 체질 돌연변이를 검출할 수 있습니다. 종양 내 이질성 및 과열 돌연변이는 수천 개의 염기에 걸쳐 게놈 영역의 깊은 시퀀싱에 의해 검출될 수 있으므로, 따라서 cfDNA의 분석은 뚜렷한 게놈^{시그니처(13)를}가진 특정 분자 아류형을 발견할 수 있게 한다. 조직 샘플을 통해 유사한 수준의 정보를 얻으려면 많은 고체 생검이 필요했을 것입니다.

더욱이, 수술 치료 및/또는 화학요법 후 결장, 난소 및 폐암과 같은 국소질환 환자의 cfDNA 수준은 암 재발 및 치료 결과에 대한 강력한 예후 마커로^{입증되었다(20).} 더욱이, 결장, 유방 및 폐암환자에서, 혈액에서 cfDNA의 분석은 성공적으로 종양 특정 변경을 검출할 수 있었습니다, 이는 사전에 재발의 정확한 예측으로 이끌어^13. 더욱이, 항EGFR 요법을 받는 CRC 환자에서 KRAS 돌연변이와 같은 치료 저항^마커(30); 다양한 치료법으로 치료 후 유방암 환자에서 PIK3CA, MED1 또는 EGFR과 같은 유전자를 위한 VAFs(31); EGFR 표적^TKIs(32)로 치료된 폐암 환자에서 EGFR T790M 저항돌연변이도 cfDNA 분석에 의해 확인될 수 있다.

요약하자면, cfDNA 분석은 종양학^{13, 33의}분야에서 정확한 바이오마커를 식별하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜에서, 3개의 신경교종 환자의 혈액 샘플 및 3개의 건강한 통제는 혈장에서 WbCs 및 cfDNA에게서 게놈 DNA를 얻기 위하여 처리되었습니다. 신경교암에서, IDH, TERT, ATRX, EGFR 및 TP53의 돌연변이는 신경교종 종양의 조기 진단에 도움이 될 수 있는 예후 마커뿐만 아니라 진단역할을 하며, 다른 유형의 신경교종 종양을 분류하고, 개별 환자를 위한 정확한 치료를 안내하고 치료 반응^34,35을이해한다. 이 유전자의 돌연변이 상태는 혈액 유래 cfDNA를 사용하여 확인할 수 있습니다. 본 원고에서는, 우리는 신경교종 암^(12)에있는 돌연변이 변경을 공부하기 위해 이용된 혈장 유래 cfDNA의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 문서에서 설명된 이러한 cfDNA 기반 액체 생검 프로토콜은 다른 많은 유형의 암에서 돌연변이 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 최근 연구는 cfDNA 기지를 둔 액체 생검이 암^36의50의 다른 모형을 검출할 수 있다는 것을 보여주었습니다.

혈액 샘플 수집, 저장 및 선적은 이러한 단계 동안 제어되지 않은 온도가 WBC의 리시스를 일으켜 WBC에서 혈장으로 게놈 DNA를 방출하고 cfDNA 샘플의 오염을 유발하기 때문에 이 프로토콜에서 중요한 단계이며, 이는^{절차(37)의}나머지 부분에 영향을 미친다. 제어되지 않은 온도로 인한 혈류용액은 PCR^{단계(38)와}같은 cfDNA의 하류 시료 준비 과정을 손상시킬 수 있다. 혈청은 혈장보다는 생식선 cfDNA의 높은 비율을 포함하지만 종양 관련 cfDNA^39에대한 큰 배경 잡음이 나타난다. 따라서 종양 관련 cfDNA를 분리하기 위해 혈장은 적합한^{샘플(39)이다.} 혈액 수집 튜브를 포함하는 항 응고제에서 그려진 혈액은 플라즈마를 분리하고 cfDNA 오염을 피하기 위해 즉시 또는 최대 2 시간 이내에 원심 분리되어야합니다. 이 프로토콜에서, 전용 상용 cfDNA 보존 혈액 수집 튜브가 사용됩니다 (재료의 표참조), 이는 혈액 수집 튜브를 포함하는 항응고제에 대한 대안이다. 이러한 전용 혈액 수집 튜브는 cfDNA 및 cfRNA를 보존하고, 주변 온도에서 최대 30일, 최대 8일 동안 37°C에서 WbC의 용액을 방지합니다. 이를 통해 혈액 샘플 선적 시 및 플라즈마 및 WBC가 분리될 때까지 적절한 온도를 유지할 수 있습니다^40.

현재 사용 가능한 cfDNA 추출 방법론에는 위상 격리, 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼 및 자기 비드 기반^{절연(41)의}세 가지 유형이 있습니다. 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼 방법은 다른 cfDNA 추출 방법에 비해 높은 무결성을 가진 높은 양의 cfDNA를^{산출하였다(42).}

DNA의 정량적 평가는 액체 생검의 근본적인 요구 사항이며, 쉽게 구현하고 광범위한 사용을 위해 간단하고 저렴하며 표준화 된 절차를 개발할 필요가 있습니다. cfDNA 정량화를 위해 일반적으로 사용되는 세 가지 방법은 분광광측정, 형광및 qPCR이다. 불소측정 방법은 정확도, 비용 및 전도의 용이성에 관한 다른 방법에 대해 더 잘^{입증된다(43)}.

cfDNA의 무결성과 순도는 아가로즈 전기포고증 또는 모세관 전기포에 의해 추정될 수 있다. 아가로스 전기 포근은 cfDNA의 낮은 농도에서 감도를 나타내지 않으며 cfDNA의 정확한 단편 크기를 표시하는 고해상도가 없습니다. 한편, 모세관 전기포는 관련 과제를 극복함으로써 아가로산 전기포에 비해 이점이 있으며, 따라서 연구원이 cfDNA 단편 크기 분석을 위해 널리 사용되고 있다. 이 프로토콜에서, 절연 된 cfDNA의 단편 크기 분포는 자동화 된 모세관 전기 포근 계측기를 사용하여 추정되었다 (재료의 표참조).

Protocol

혈액 수집 전에 연구에 참여하는 과목의 정보에 입각한 동의가 필요하며 반드시 얻어야 합니다. 이 원고에 설명 된 연구는 라빈 의료 센터, 이스라엘 윤리위원회 (윤리 코드 : 0039-17-RMC)와 의학 교수 Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, 독일 윤리위원회 (윤리 코드: D 405/14)에 따라 수행되었다. 1. cfDNA 또는 cfRNA 방부제 관에 혈액 샘플 수집 및 저장 보존 튜브에 적절하게 라?…

Representative Results

플라즈마 분리cfDNA 또는 cfRNA 방부제 관에서 채취한 8.5-9 mL 혈액은 부피에서 ~4mL 플라즈마 주위의 수율을 냅니다. EDTA 튜브에서 채취한 혈액으로부터 분리된 혈장의 양은 온도에 따라 달라질 수 있다. 37°C 이상의 온도에서 혈액을 함유하는 EDTA 튜브의 노출은 혈장 부피수율(44)을감소시다. 불소계 분석 결과각 신경교종 환자의 1mL…

Discussion

튜브, 선적 및 저장에 환자의 혈액의 수집은 액체 생검에 중요한 초기 단계입니다. 부적절한 취급은 플라즈마의 품질을 손상시킬 수 있으므로 액체^{생검(47)의}결과를 방해할 수 있다. 혈액 샘플이 EDTA 혈액 관에서 수집되는 경우, 혈장은 WbCs의 리시스를 피하고^{혈장(48)으로}게놈 DNA를 방출하기 위해 혈액 수집의 2 시간 이내에 분리되어야합니다. WbCs는 또한 더 긴 시…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C