Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Summary

Bu yazıda kan toplama, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA’nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere invaziv olmayan sıvı biyopsi tekniği için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Kanser hastalarının tümörlerindeki mutasyonların belirlenmesi hastalık yönetiminde çok önemli bir adımdır. Bu mutasyonlar tümör tanısının yanı sıra kanser hastalarında tedavi seçimi ve yanıtı için biyobelirteç görevi görür. Tümör mutasyonlarını tespit etmek için mevcut altın standart yöntem, tümör biyopsileri yoluyla tümör DNA’sının genetik testini içerir. Ancak bu invaziv yöntemin tümör mutasyon repertuarının takip testi olarak tekrar tekrar yapılması zordur. Sıvı biyopsisi, tümör mutasyonlarını kullanımı kolay ve invaziv olmayan bir biyopsi yaklaşımı olarak tespit etmek için yeni ve gelişmekte olan bir tekniktir.

Kanser hücreleri hızla çoğalır. Buna paralel olarak, çok sayıda kanser hücresine apoptoz geçiriliyor. Bu hücrelerden elde edilen döküntüler, tümör DNA mutasyonları taşıyan hücresiz DNA (cfDNA) parçaları adı verilen ince parçalanmış DNA parçalarıyla birlikte hastanın dolaşım sistemine salınır. Bu nedenle, sıvı biyopsi tekniği kullanılarak CFDNA bazlı biyobelirteçlerin tanımlanması için kanser hastalarından kan örnekleri toplanır, ardından plazma ve buffy coat ayrılması yapılır. Daha sonra, plazma cfDNA’nın izolasyonu için işlenir ve ilgili buffy kat hastanın genomik DNA’sının izolasyonu için işlenir. Her iki nükleik asit örneği de daha sonra miktarları ve kaliteleri için kontrol edilir; ve yeni nesil dizileme (NGS) teknikleri kullanılarak mutasyonlar için analiz edildi.

Bu yazıda, sıvı biyopsisi için kan alma, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA’nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Introduction

Teknolojik gelişmeler yüzlerce kanser genomunun ve transkriptomlarının dizilimine yol açmıştır¹. Bu, farklı kanser türleri 2’deki moleküler değişikliklerin manzaralarının anlaşılmasına katkıda^{bulunmuştur.} Bu manzaralar üzerinde yapılan diğer çalışmalar, apoptoz yollarını seri olarak bozarak kanser veya tümör ilerlemesinde rol oynayan sıralı somatik değişiklikler ve gen-gen füzyonları^3’ün karakterize olmasına yardımcı oldu⁴. Bu nedenle, somatik mutasyonlar ve gen-gen füzyonları, belirli bir tümör tip⁵için tek tek hastalarda biyobelirteç görevi görerek tümörler hakkında bilgi sağlayabilir , mevcut primer tümörlerin prognozunu⁶olarak tanımlayabilir, ikincil tümörleri moleküler değişikliklere göre kategorize^{edebilir 7}ve ilaçlanabilir tümör hedeflerini tanımlayabilir^8. Bu tür bilgiler kanser hastaları için kişiselleştirilmiş tedavinin seçilmesinde ve olumlu ve olumsuz tedavi yanıtlarının belirlenmesinde kolaylaştırabilir⁹. Bununla birlikte, tümör dokusunun genomik profillenmesini tanımlamak için tümör materyali elde etmek invaziv bir prosedürdür¹⁰. Ayrıca, bir tümör biyopsisi heterojen tümörün sadece küçük bir kısmını içerir; ve bu nedenle, tüm tümörün moleküler profili için temsili olmayabilir¹¹. Seri izleme ve tümör genotipleme, tümör biyopsi prosedürünün invazivliği ve bu prosedürlerden kaynaklanan güvenlik sorunları nedeniyle genellikle mümkün olmayan tümör dokularının tekrar tekrar toplanmasını gerektirir¹².

Sıvı biyopsi tekniği ise son on yılda hassas onkolojide büyük ilgi gördü^13,14. Esas olarak bu tekniğin invaziv olmamasından ve birden fazla zaman noktasında tekrarlanma olasılığından kaynaklanır, böylece hastalık kursları için kullanımı kolay ve güvenli bir izleme tekniği sağlar^15,16. Sıvı biyopsisi, tümör hücrelerinin hızla çoğaldığı ve aynı anda birçoğunun apoptoz ve nekroz geçirdiği bir fenomene dayanmaktadır. Bu, apoptotik hücre kalıntılarının hastaların kanına salınmasına yol açar, apoptoz sırasında kesin boyutlarda kesilen DNA parçaları ile birlikte¹⁷. Kanserli olmayan hücrelerin apoptozları da hücresel kalıntılarının kana salınmasına yol açar, ancak bu hücrelerdeki apoptoz oranı tümör hücrelerinden nispeten daha düşüktür¹⁸. Sıvı biyopsi tekniğinin mantığı, kanda sürekli dolaşan DNA, RNA, proteinler ve tümör hücreleri^14,19 gibi tümörle ilişkili molekülleri yakalamaktır. Bu moleküllerin analizi için Yeni Nesil Dizileme (NGS), dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR), gerçek zamanlı PCR ve enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) dahil olmak üzere çeşitli teknikler²⁰ kullanılabilir. Sıvı biyopsi tekniği, tümör hücrelerinin özellikleri olan biyobelirteçlerin tanımlanmasını sağlar. Bu biyobelirteç molekülleri sadece bir tümörün belirli bölgelerinden değil, tümörün tüm bölümlerinden salınır²¹. Bu nedenle, sıvı biyopsisinde tanımlanan belirteçler, vücuttaki diğer tümörlere ek olarak, tüm heterojen tümörün moleküler profillemini temsil eder, böylece doku biyopsisi tabanlı tekniğe göre avantajlara sahiptir²².

CfDNA’nın dolaşımdaki kanda birkaç dakika ile 1-2 saat arasında değişen kısa bir yarı ömür süresi^{vardır 23}. Ancak cfDNA’nın kısa yarı ömrü, tedavi yanıtı ve dinamik tümör değerlendirmelerini değerlendirerek gerçek zamanlı analizleri kolaylaştırır. Tümörden türetilmiş cfDNA düzeyleri, cfDNA düzeyleri ile sağkalım sonuçları arasında bir ilişki olduğunu gösteren çeşitli çalışmalarla kanıtlanan tümör evresinin / boyutunun prognostikasyonunu göstermektedir²⁴. Ayrıca, çalışmalar cfDNA’nın mevcut tümör belirteçlerinden daha iyi bir tahmin kapasitesine sahip olduğunu kanıtlamıştır²⁵. CfDNA’nın prognostikasyonu kanser tedavisinden sonra daha da belirgindir, tedaviden sonra daha yüksek cfDNA seviyeleri, daha düşük bir sağkalım oranı ve tedaviye direnç ile iyi ilişkilidir. Tedaviyi takiben cfDNA’nın daha düşük seviyeleri genellikle pozitif tedavi yanıtına karşılık gelir. Ek olarak, cfDNA geleneksel algılama yöntemlerine göre tedavi yanıtının erken tespitini kolaylaştırır.

CfDNA, kanserle ilişkili mutasyonların erken teşhis olasılığını arttırır: erken evre hastalık¹⁵, semptomların başlangıcı²⁶ ve kanser tanısından önce 2 yıla kadar²⁷. CfDNA birden fazla tümör bölgesinden veya odaklardan salındığı için, analizi temsil ettiği tümör genomunun kapsamlı bir görünümünü sağlar²⁸. Bu nedenle, cfDNA doku örneklerinde kaçırılmış olabilecek somatik mutasyonları tespit etmeyi sağlar²⁹. Tümör içi heterojenlik ve subklonal mutasyonlar binlerce baza yayılan genomik bölgelerin derin dizilimi ile tespit edilebildiğinden, cfDNA’nın analizi farklı genomik imzalara sahip spesifik moleküler alt tiplerin ortaya çıkarılmasına olanak sağlar¹³. Doku örneği ile benzer düzeyde bilgi elde etmek için birçok katı biyopsiye ihtiyaç duyulacaktı.

Ayrıca, cerrahi tedavi ve/veya kemoterapi sonrası kolon, yumurtalık ve akciğer kanseri gibi lokalize bir hastalığı olan hastalarda cfDNA düzeylerinin kanser nüks ve tedavi sonuçları için güçlü bir prognostik belirteç olduğu gösterilmiştir^20. Ayrıca, kolon, meme ve akciğer kanseri olan hastalarda, kandan cfDNA analizleri tümöre özgü değişiklikleri başarıyla tespit edebilir, bu da birkaç ay önceden nüksün kesin tahminine yol açtı¹³. Ayrıca, anti-EGFR tedavisi alan CRC’li hastalarda KRAS mutasyonları gibi tedavi direnci belirteçleri^30; Çeşitli tedaviler ile tedavi sonrası meme kanseri olan hastalarda PIK3CA, MED1 veya EGFR gibi genler için VAF’lar^31; ve EGFR hedefli TKIs³² ile tedavi edilen akciğer kanseri hastalarında EGFR T790M direnç mutasyonu cfDNA analizi ile de tanımlanabilir.

Özetle, cfDNA analizi onkoloji alanında hassas biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir^13,33. Bu protokolde 3 glioma hastasının kan örnekleri ve 3 sağlıklı kontrolle WBC’lerden genomik DNA ve plazmadan CFDNA elde edildi. Glioma kanserinde, IDH, TERT, ATRX, EGFR ve TP53’teki mutasyonlar, glioma tümörlerinin erken tanısında yardımcı olabilecek, farklı glioma tümörlerini sınıflandırabilecek, bireysel hasta için doğru tedaviye rehberlik eden ve tedavi yanıtını anlayan prognostik belirteçler olarak hizmet vermektedir^34,35. Bu genlerin mutasyon durumu kan türevi cfDNA kullanılarak tanımlanabilir. Bu yazıda, glioma kanserindeki mutasyonel değişiklikleri incelemek için kullanılan plazma türevi cfDNA’nın ayrıntılı bir protokolünü sunuyoruz¹². Bu makalede açıklanan cfDNA tabanlı sıvı biyopsi protokolü, diğer birçok kanser türünde mutasyonel değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, yeni bir çalışma cfDNA bazlı sıvı biyopsinin 50 farklı kanser türünü tespit³⁶.

Kan örneği toplama, depolama ve sevkiyat bu protokolde çok önemli adımlardır, çünkü bu adımlar sırasında kontrolsüz sıcaklık WBC’lerin lizizine neden olur, WBC’den plazmaya genomik DNA salınması ve prosedürün geri kalanını etkileyen cfDNA örneğinin kirlenmesine neden olur³⁷. Kontrolsüz sıcaklığa bağlı hemoliz, PCR adımları³⁸gibi cfDNA’nın aşağı akış numune hazırlama süreçlerini bozabilir. Serum plazma yerine yüksek oranda germline cfDNA içerir, ancak tümörle ilişkili cfDNA³⁹için büyük bir arka plan gürültüsü sunar. Bu nedenle, tümörle ilişkili cfDNA’yı izole etmek için plazma uygun bir örnektir³⁹. Kan alma tüpü içeren bir pıhtılaştırıcıya çekilen kan, plazmayı ayırmak ve CFDNA kontaminasyonünü önlemek için derhal veya iki saate kadar santrifüjlenmelidir. Bu protokolde, kan alma tüpleri içeren antikoagülanlara alternatif olan özel ticari cfDNA koruma kan alma tüpleri kullanılmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu). Bu özel kan alma tüpleri cfDNA ve cfRNA’yı korur ve WBC’lerin lizizini ortam sıcaklığında 30 güne kadar ve 37 °C’de 8 güne kadar önler. Bu, bir kan örneği sevkiyatı sırasında ve plazma ve WBC ayrılana kadar uygun sıcaklığın korunmasını kolaylaştırır⁴⁰.

Şu anda üç tür cfDNA ekstraksiyon metodolojisi vardır: faz izolasyonu, silikon-membran bazlı spin sütunu ve manyetik boncuk bazlı izolasyon⁴¹. Silikon-membran bazlı spin sütun yöntemi, diğer cfDNA ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla yüksek bütünlüğe sahip yüksek miktarda cfDNA verdi⁴².

DNA’nın nicel değerlendirilmesi sıvı biyopsisinde temel bir gerekliliktir, kolay uygulanması ve geniş kullanımı için basit, uygun fiyatlı ve standartlaştırılmış bir prosedür geliştirmeye ihtiyaç vardır. CfDNA nicelemesi için yaygın olarak kullanılan üç yöntem spektrofotometrik, florometrik ve qPCR’dir. Florometrik yöntem doğruluk, maliyet ve iletim kolaylığı ile ilgili diğer yöntemlere göre daha iyi kanıtlanmıştır⁴³.

CfDNA’nın bütünlüğü ve saflığı agarose elektroforez veya kılcal elektroforez ile tahmin edilebilir. Agarose elektroforez ne düşük cfDNA konsantrasyonunda hassasiyet gösterir ne de cfDNA’nın hassas parça boyutunu göstermek için yüksek çözünürlüğe sahiptir. Öte yandan, kılcal elektroforez, ilişkili zorlukların üstesinden gelmekle agarose elektroforez üzerinde bir avantaja sahiptir ve bu nedenle araştırmacılar tarafından cfDNA parça boyutu analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokolde, izole edilmiş cfDNA’nın parça boyutu dağılımı otomatik kılcal elektroforez cihazı kullanılarak tahmin edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).

Protocol

Kan alamadan önce, araştırmaya katılan deneklerden bilgilendirilmiş onay alınması ve alınması gerekir. Bu yazıda açıklanan araştırma Rabin Tıp Merkezi, İsrail etik komitesi (etik kod: 0039-17-RMC) ve Tıp Fakültesi Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Almanya etik komitesine (etik kod: D 405/14) uygun ve uygun olarak gerçeklenmiştir. 1. CfDNA veya cfRNA koruyucu tüplerde kan örneği toplama ve depolama Koruma tüplerini uygun şekilde etiketle …

Representative Results

Plazma AyırmaCfDNA veya cfRNA koruyucu tüplerde toplanan 8,5-9 mL kan, hacim olarak yaklaşık 4 mL plazma verir. EDTA tüplerinde toplanan kandan ayrılan plazma hacmi sıcaklığa bağlı olarak değişebilir. Kan içeren EDTA tüplerinin 37 °C’den yüksek bir sıcaklıkta maruz kalması plazma hacmi veriminin düşmesine yol açar44. Florometre Tahlil Sonuçlarıglioma hastalarının her birinin 1 mL plazmasında cfDNA kon…

Discussion

Bir hastanın kanının bir tüpte toplanması, sevkıyat ve depolanmasının sıvı biyopsisinde ilk adımlar çok önemli olduğunu. Yanlış kullanım plazmanın kalitesini bozabilir ve bu nedenle sıvı biyopsi sonuçlarına müdahale edebilir⁴⁷. Bir EDTA kan tüpünde kan örneği toplanırsa, WBC’lerin lizizini önlemek ve genomik DNA’sının plazma^48’esalınmasını önlemek için plazmanın kan toplandıktan sonraki iki saat içinde ayrılması gerekir. WBC’ler daha…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C