Administración Intratraqueal De La Formulación De Polvo Seco En Ratones

Summary

Las formulaciones de polvo seco para inhalación tienen un gran potencial en el tratamiento de enfermedades respiratorias. Antes de entrar en estudios en humanos, es necesario evaluar la eficacia de la formulación de polvo seco en estudios preclínicos. Un método simple y no invasor de la administración del polvo seco en ratones a través de la ruta intratraqueal se presenta.

Abstract

En el desarrollo de formulaciones de polvo seco inhalable, es esencial evaluar sus actividades biológicas en modelos animales preclínicos. Este papel introduce un método no invasor de entrega intratraqueal de la formulación seca del polvo en ratones. Se presenta un dispositivo de carga de polvo seco que consiste en una punta de pipeta de carga de gel de 200 μL conectada a una jeringa de 1 mL a través de una llave de paso de tres vías. Una pequeña cantidad de polvo seco (1-2 mg) se carga en la punta de la pipeta y se dispersa por 0.6 ml de aire en la jeringa. Debido a que las puntas de pipeta son desechables y baratas, diferentes formulaciones de polvo seco se pueden cargar en diferentes puntas de antemano. Se pueden evaluar varias formulaciones en el mismo experimento animal sin necesidad de limpiar el dispositivo y rellenar la dosis, ahorrando así tiempo y eliminando el riesgo de contaminación cruzada del polvo residual. El grado de dispersión del polvo se puede inspeccionar por la cantidad de polvo restante en la punta de la pipeta. Se incluye un protocolo de intubación en ratón con una fuente de luz a medida y una cánula guía. La intubación adecuada es uno de los factores clave que influye en la entrega intratraqueal de la formulación de polvo seco a la región pulmonar profunda del ratón.

Introduction

La vía pulmonar de administración ofrece diversos beneficios en la entrega de terapias para acciones locales y sistémicas. Para el tratamiento de enfermedades pulmonares, la alta concentración local de la droga se puede alcanzar por la entrega pulmonar, de tal modo reduciendo la dosis requerida y bajando la incidencia de efectos secundarios sistémicos. Por otra parte, las actividades enzimáticas relativamente bajas en el pulmón pueden reducir metabolismo prematuro de la droga. Los pulmones también son eficientes para la absorción de fármacos para la acción sistémica debido a la gran superficie bien perfundida, la capa extremadamente delgada de células epiteliales y el alto volumen de sangre en capilares pulmonares^1.

Las formulaciones de polvo seco inhalado han sido ampliamente investigadas para la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la diabetes mellitus y la vacunación pulmonar^2,3,4. Los fármacos en estado sólido son generalmente más estables que en forma líquida, y los inhaladores de polvo seco son más portátiles y fáciles de usar que los nebulizadores^5,6. En el desarrollo de formulaciones de polvo seco inhalado, la seguridad, el perfil farmacocinético y la eficacia terapéutica necesitan ser evaluados en modelos animales preclínicos después de la administración pulmonar^7. A diferencia de los seres humanos que pueden inhalar polvo seco activamente, la entrega pulmonar de polvo seco a animales pequeños es un desafío. Es necesario establecer un protocolo eficiente de entrega de polvo seco a los pulmones de los animales.

Los ratones son ampliamente utilizados como modelos de animales de investigación porque son económicos y se reproducen bien. También son fáciles de manejar y muchos modelos de enfermedades están bien establecidos. Existen dos enfoques principales para administrar polvo seco al pulmón del ratón: inhalación y administración intratraqueal. Para la inhalación, el ratón se coloca en una cámara de cuerpo entero o sólo de nariz donde se aerosoliza polvo seco y los animales respiran el aerosol sin sedación^8,9. Se requiere un equipo costoso y la eficiencia de la administración de medicamentos es baja. Mientras que la cámara de todo el cuerpo puede ser técnicamente menos desafiante, la cámara de exposición solo para la nariz podría minimizar la exposición de los medicamentos a la superficie del cuerpo. En cualquier caso, todavía es difícil controlar y determinar con precisión la dosis administrada a los pulmones. El polvo seco se deposita principalmente en la región nasofaringe donde el aclaramiento mucociliar es prominente¹⁰. Además, los ratones dentro de la cámara están bajo un estrés significativo durante el proceso de administración porque están limitados y privados del suministro de alimentos y agua¹¹. Para la administración intratraqueal, generalmente se refiere a la introducción de la sustancia directamente en la tráquea. Existen dos técnicas diferentes para lograrlo: la traqueotomía y la intubación orotraqueal. El primero requiere un procedimiento quirúrgico que hace una incisión en la tráquea, que es invasiva y rara vez se utiliza para la administración de polvo. Solamente la segunda técnica se describe aquí. En comparación con el método de inhalación, la administración intratraqueal es el método más comúnmente utilizado para la administración pulmonar en el ratón debido a su alta eficiencia de administración con una pérdida mínima de fármacos^12,13. Es un método simple y rápido para entregar con precisión una pequeña cantidad de polvo dentro de unos pocos miligramos al ratón. Aunque el ratón es anatómica y fisiológicamente distinto a los humanos y se requiere anestesia durante el proceso de intubación, la administración intratraqueal pasa por alto las vías respiratorias superiores y ofrece una forma más efectiva de evaluar las actividades biológicas de la formulación de polvo seco, como la absorción pulmonar, la biodisponibilidad y los efectos terapéuticos^14,15.

Para administrar polvo seco por vía intratraqueal, el ratón tiene que ser intubado, lo que podría ser un desafío. En este papel, la fabricación de un insufflator seco hecho a medida del polvo y de un dispositivo de la intubación se describe. Se demuestran los procedimientos de intubación e insuflación de polvo seco en el pulmón del ratón.

Protocol

Los experimentos realizados en este estudio han sido aprobados por el Comité sobre el Uso de Animales Vivos para la Enseñanza y la Investigación (CULATR), la Universidad de Hong Kong. Las formulaciones en polvo seco preparadas por liofilización por pulverización (SFD) que contienen 0,5% de ARN mensajero de luciferasa (ARNm), péptido sintético PEG12KL4 al 5% y 94,5% de manitol (p/p) se utilizan en este estudio para demostrar la expresión de ARNm en el pulmón16. El diámetro aero…

Representative Results

Cuando se utiliza un insuflador de polvo seco para entregar aerosol en polvo al pulmón de un animal, el volumen de aire utilizado es crítico, ya que afecta la seguridad, así como la eficiencia de la dispersión del polvo. Para optimizar el método, se utilizaron diferentes volúmenes de aire (0,3 mL, 0,6 mL y 1,0 mL) para dispersar el polvo seco (1 mg de manitol secado por aspersión) y se monitorizó el peso de los ratones durante 48 horas después de la administración(Figura 6). El uso…

Discussion

En este papel, los dispositivos hechos a medida para la insuflación seca del polvo y la intubación intratraqueal se presentan. En la etapa de carga de polvo, el polvo seco se carga en una punta de pipeta de carga de gel de 200 μL. Es importante tocar suavemente la punta para permitir el embalaje suelto de polvo en el extremo estrecho de la punta. Sin embargo, si el polvo se empaqueta demasiado apretado, se atascarán en la punta y no se pueden dispersar adecuadamente. Se recomienda neutralizar las cargas estáticas de…

Materials

BALB/c mouse			Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g
CleanCap Firefly Luciferase mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
Dry Powder Insufflator	PennCentury	Model DP-4M
Ketamine 10%	Alfasan International B.V.	NA
Light emitting diode (LED) torch	Unilite Internation	PS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)	Roquette	450001
Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL)	Labcon	1034-800-000
Nylon floss	Reach	30017050
One milliliter syringe without needle	Terumo	SS-01T
Optical fibre	Fibre Data	OMPF1000
PEG12KL4 peptide	EZ Biolab		(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2
Plastic Pasteur fine tip pipette	Alpha Labotatories	LW4061
Three-way stopcock	Braun	D201
Xylazine 2%	Alfasan International B.V.	NA
Zerostat 3 anti-static gun	MILTY	5036694022153