Intratracheal administration af tør pulverformulering hos mus

Summary

Tørpulverformuleringer til indånding har et stort potentiale i behandling af luftvejssygdomme. Før du går ind i humane undersøgelser, er det nødvendigt at evaluere effekten af den tørre pulverformulering i prækliniske undersøgelser. Der præsenteres en enkel og ikke-invasiv metode til indgift af tørt pulver i mus gennem intratracheal ruten.

Abstract

I udviklingen af inhalerbare pulverformuleringer er det vigtigt at evaluere deres biologiske aktiviteter i prækliniske dyremodeller. Dette papir introducerer en ikke-invasiv metode til intratracheal levering af tør pulverformulering hos mus. En tør pulverbelastningsanordning, der består af en 200 μL gellæssning pipettespids forbundet til en 1 mL sprøjte via en trevejs stophane præsenteres. En lille mængde tørt pulver (1-2 mg) læsses i pipettespidsen og spredes med 0,6 mL luft i sprøjten. Fordi pipette tips er engangstændere og billige, forskellige tørre pulver formuleringer kan indlæses i forskellige tips på forhånd. Forskellige formuleringer kan evalueres i det samme dyreforsøg uden anordningrensning og dosispåfyldning, hvilket sparer tid og eliminerer risikoen for krydskontaminering fra restpulver. Omfanget af pulverspredning kan kontrolleres af mængden af pulver, der er tilbage i pipettespidsen. En protokol for intubation i mus med en skræddersyet lyskilde og en vejledende kanyle er inkluderet. Korrekt intubation er en af de vigtigste faktorer, der påvirker intratracheal levering af tør pulverformulering til musens dybe lungeregion.

Introduction

Den lungemæssige indgiftsmåde giver forskellige fordele ved at levere terapi til både lokale og systemiske handlinger. Til behandling af lungesygdomme kan høj lokal lægemiddelkoncentration opnås ved lungelevering, hvilket reducerer den krævede dosis og sænker forekomsten af systemiske bivirkninger. Desuden kan de relativt lave enzymatiske aktiviteter i lungerne reducere for tidlig lægemiddelmetabolisme. Lungerne er også effektive til lægemiddelabsorption for systemisk virkning på grund af det store og godt perfunderede overfladeareal, det ekstremt tynde epitelcellelag og det høje blodvolumen i lungekapillærer¹.

Inhalerede tørpulverformuleringer er blevet undersøgt bredt til forebyggelse og behandling af forskellige sygdomme som astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, diabetes mellitus og lungevaccination^2,3,4. Stoffer i fast tilstand er generelt mere stabile end i flydende form, og tør pulverinhalatorer er mere bærbare og brugervenlige end forstøvere^5,6. Ved udviklingen af inhalerede pulverformuleringer skal sikkerheden, den farmakokinetiske profil og den terapeutiske effekt evalueres i prækliniske dyremodeller efter lungeindgift⁷. I modsætning til mennesker, der aktivt kan indånde tørt pulver, er lungelevering af tørt pulver til små dyr udfordrende. Det er nødvendigt at etablere en effektiv protokol for levering af tørt pulver til dyrenes lunger.

Mus er meget udbredt som forskning dyremodeller, fordi de er økonomiske, og de yngler godt. De er også nemme at håndtere, og mange sygdomsmodeller er veletablerede. Der er to vigtige metoder til at administrere tørt pulver til musens lunge: indånding og intratracheal administration. Til indånding placeres musen i et helkrops- eller næsekammer, hvor tørt pulver aerosoliseres, og dyrene indånder aerosolen uden sedation^8,9. Dyrt udstyr er påkrævet, og leveringseffektiviteten for lægemidler er lav. Mens hele kroppen kammer kan være teknisk mindre udfordrende, næse-only eksponering kammer kunne minimere eksponering af lægemidler til kroppens overflade. Uanset hvad er det stadig svært at præcist kontrollere og bestemme den dosis, der leveres til lungerne. Det tørre pulver deponeres hovedsageligt i nasopharynx-regionen, hvor slimhindefrigøring er fremtrædende¹⁰. Desuden er mus inde i kammeret under betydelig stress under administrationsprocessen, fordi de er begrænset og berøvet mad og vandforsyning¹¹. Ved intratracheal indgift henviser det generelt til indslæbning af stoffet direkte i luftrøret. Der er to forskellige teknikker til at opnå dette: trakeotomi og orotracheal intubation. Førstnævnte kræver en kirurgisk procedure, der gør et snit i luftrøret, som er invasiv og sjældent anvendes til pulver administration. Kun den anden teknik er beskrevet her. Sammenlignet med indåndingsmetoden er intratracheal administration den mere almindeligt anvendte metode til lungelevering i musen på grund af dens høje leveringseffektivitet med minimalt lægemiddeltab^12,13. Det er en enkel og hurtig metode til præcist at levere en lille mængde pulver inden for et par milligram til musen. Selvom musen er anatomisk og fysiologisk forskellig fra mennesker, og bedøvelse er påkrævet under intubationsprocessen, omgår intratracheal administration de øvre luftveje og tilbyder en mere effektiv måde at vurdere de biologiske aktiviteter i den tørre pulverformulering som lungeabsorption, biotilgængelighed og terapeutiske virkninger^14,15.

For at administrere tørt pulver intratracheally skal musen intuberes, hvilket kan være udfordrende. I dette papir beskrives fremstillingen af en specialfremstillet tør pulverlysdæmper og en intubationsanordning. Procedurerne for intubation og insufflation af tørt pulver i musens lunge er påvist.

Protocol

Forsøgene i denne undersøgelse er blevet godkendt af Udvalget for Brug af Levende Dyr til Undervisning og Forskning (CULATR), University of Hong Kong. I denne undersøgelse anvendes 5% syntetisk peptid PEG12KL4 og 94,5% af mannitol (w/w) i denne undersøgelse til at påvise mRNA-ekspression i lungerne16. Massen median aerodynamisk diameter (MMAD) af SFD pulver er 2,4 μm. Sprøjtetørret (SD) mannitolpulver anvendes til at undersøge effekten af luftvolumen, der anvendes i pulverspred…

Representative Results

Når en tør pulver insufflator bruges til at levere pulver aerosol til lungen af et dyr, mængden af luft, der anvendes, er kritisk, da det påvirker sikkerheden samt pulver spredning effektivitet. For at optimere metoden blev der anvendt forskellige luftmængder (0,3 mL, 0,6 mL og 1,0 mL) til at sprede det tørre pulver (1 mg spraytørret mannitol), og musenes vægt blev overvåget i 48 timer efter indgift(figur 6). Brugen af 0,3 mL og 0,6 mL luft forårsagede ikke vægttab hos musene op t…

Discussion

I dette papir præsenteres skræddersyede enheder til tør pulverinsufflation og intratracheal intubation. I pulverbelastningstrinnet læsses tørt pulver i en 200 μL gel-loading pipettespids. Det er vigtigt forsigtigt at trykke på spidsen for at tillade løs pakning af pulver i den smalle ende af spidsen. Men hvis pulveret er pakket for tæt, vil de sidde fast i spidsen og kan ikke spredes korrekt. Det anbefales at neutralisere pulverets statiske ladninger og pipettespidsen for at lette pulverbelastningen, især for p…

Materials

BALB/c mouse			Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g
CleanCap Firefly Luciferase mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
Dry Powder Insufflator	PennCentury	Model DP-4M
Ketamine 10%	Alfasan International B.V.	NA
Light emitting diode (LED) torch	Unilite Internation	PS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)	Roquette	450001
Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL)	Labcon	1034-800-000
Nylon floss	Reach	30017050
One milliliter syringe without needle	Terumo	SS-01T
Optical fibre	Fibre Data	OMPF1000
PEG12KL4 peptide	EZ Biolab		(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2
Plastic Pasteur fine tip pipette	Alpha Labotatories	LW4061
Three-way stopcock	Braun	D201
Xylazine 2%	Alfasan International B.V.	NA
Zerostat 3 anti-static gun	MILTY	5036694022153