Intratrakeal administrering av torrpulverformulering hos möss

Summary

Torrpulver formuleringar för inandning har stor potential vid behandling av luftvägssjukdomar. Innan du går in i studier på människa är det nödvändigt att utvärdera effekten av den torra pulverformuleringen i prekliniska studier. En enkel och noninvasive metod för administrering av torrt pulver hos möss genom intratrakeal vägen presenteras.

Abstract

Vid utveckling av inhalerbara torrpulverformuleringar är det viktigt att utvärdera deras biologiska aktiviteter i prekliniska djurmodeller. Detta dokument introducerar en icke-invasiv metod för intratrakeal leverans av torrpulverformulering hos möss. En torr pulverlastanordning som består av en 200 μL gelbelastningspipettspets ansluten till en 1 ml spruta via en trevägskran presenteras. En liten mängd torrt pulver (1-2 mg) laddas i pipettspetsen och sprids med 0,6 ml luft i sprutan. Eftersom pipettspetsar är engångs- och billiga kan olika torrpulverformuleringar laddas i olika spetsar i förväg. Olika formuleringar kan utvärderas i samma djurförsök utan att enheten rengörs och dospåfylls, vilket sparar tid och eliminerar risken för korskontaminering från restpulver. Omfattningen av pulverdispersionen kan inspekteras med hjälp av mängden pulver som finns kvar i pipettspetsen. Ett protokoll med intubering i musen med en skräddarsydd ljuskälla och en vägledande kanyl ingår. Korrekt intubering är en av de viktigaste faktorerna som påverkar intratrakeal leverans av torrpulverformulering till musens djupa lungregion.

Introduction

Pulmonell administreringsväg erbjuder olika fördelar med att leverera terapier för både lokala och systemiska åtgärder. För behandling av lungsjukdomar kan hög lokal läkemedelskoncentration uppnås genom lungtillförsel, vilket minskar den erforderliga dosen och sänker förekomsten av systemiska biverkningar. Dessutom kan de relativt låga enzymatiska aktiviteterna i lungan minska för tidig läkemedelsmetabolism. Lungorna är också effektiva för läkemedelsabsorption för systemisk verkan på grund av den stora och välperfunderade ytan, det extremt tunna epitelcellskiktet och den höga blodvolymen i lung kapillärer¹.

Inhalerade torrpulver formuleringar har undersökts allmänt för förebyggande och behandling av olika sjukdomar såsom astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, diabetes mellitus och lungvaccination^2,3,4. Läkemedel i fast tillstånd är i allmänhet stabilare än i flytande form, och torra pulverinhalatorer är mer bärbara och användarvänliga än nebulisatorer^5,6. Vid utveckling av inhalerade torrpulverformuleringar måste säkerheten, den farmakokinetiska profilen och den terapeutiska effekten utvärderas i prekliniska djurmodeller efter lung^{administrering 7}. Till skillnad från människor som kan andas in torrt pulver aktivt är lungtillförsel av torrt pulver till små djur utmanande. Det är nödvändigt att upprätta ett effektivt protokoll för att leverera torrt pulver till djurens lungor.

Möss används ofta som forskningsdjurmodeller eftersom de är ekonomiska och de odlar bra. De är också lätta att hantera och många sjukdomsmodeller är väletablerade. Det finns två viktiga metoder för att administrera torrt pulver till musens lunga: inandning och intratrakeal administrering. För inandning placeras musen i en helkropps- eller näskammare där torrt pulver aerosoliseras och djuren andas in aerosolen utan sedering^8,9. Dyr utrustning krävs och drogtillförseleffektiviteten är låg. Medan hela kroppen kammaren kan vara tekniskt mindre utmanande, näsa-endast exponering kammaren kan minimera exponeringskammaren för att minimera exponeringen av läkemedel mot kroppsytan. Oavsett är det fortfarande svårt att exakt kontrollera och bestämma dosen som levereras till lungorna. Det torra pulvret deponeras huvudsakligen i nasopharynx-regionen där mucociliary clearance är framträdande¹⁰. Dessutom är möss inuti kammaren under betydande stress under administreringsprocessen eftersom de är begränsade och berövade mat- och vattenförsörjning¹¹. För intratrakeal administrering avser det i allmänhet införandet av ämnet direkt i luftstrupen. Det finns två olika tekniker för att uppnå detta: trakeotomi och orotrakeal intubation. Den förstnämnda kräver ett kirurgiskt ingrepp som gör ett snitt i luftstrupen, som är invasiv och sällan används för pulveradministration. Endast den andra tekniken beskrivs här. Jämfört med inandningsmetoden är intratrakeal administrering den vanligare metoden för lungtillförsel i musen på grund av dess höga leveranseffektivitet med minimal läkemedelsförlust^12,13. Det är en enkel och snabb metod att exakt leverera en liten mängd pulver inom några milligram till musen. Även om musen är anatomiskt och fysiologiskt distinkt för människor och anestetisering krävs under intuberingsprocessen, kringgår intratrakeal administrering övre luftvägarna och erbjuder ett effektivare sätt att bedöma de biologiska aktiviteterna i torrpulverformuleringen såsom lungabsorption, biotillgänglighet och terapeutiska effekter^14,15.

För att administrera torrt pulver intratracheally måste musen intuberas, vilket kan vara utmanande. I detta dokument beskrivs tillverkningen av en skräddarsydd torr pulverinsufflator och en intubation enhet. Förfarandena för intubation och insufflation av torrt pulver i musens lunga påvisas.

Protocol

De experiment som utförts i denna studie har godkänts av Kommittén för användning av levande djur för undervisning och forskning (CULATR), University of Hong Kong. Torrpulver formuleringar beredda genom sprayfrysning torkning (SFD) som innehåller 0,5% av luciferas budbärare RNA (mRNA), 5% syntetisk peptid PEG12KL4 och 94,5% av mannitol (w/w) används i denna studie för att påvisa mRNA uttryck ilungan 16. Den aerodynamiska diametern (MMAD) för SFD-pulver är 2,4 μm. Spraytork…

Representative Results

När en torr pulverinsufflator används för att leverera pulver aerosol till lungan hos ett djur, är volymen av luft som används avgörande eftersom det påverkar säkerheten såväl som pulverdispersionseffektiviteten. För att optimera metoden användes olika luftvolymer (0,3 ml, 0, 6 ml och 1,0 ml) för att sprida det torra pulvret (1 mg spraytorkad mannitol) och mössens vikt övervakades i 48 timmar efter administrering (figur 6). Användningen av 0,3 ml och 0,6 ml luft orsakade inte…

Discussion

I detta dokument presenteras skräddarsydda enheter för torr pulver insufflation och intratrakeal intubation. I pulverlastningssteget lastas torrt pulver i en 200 μL gellastande pipettspets. Det är viktigt att försiktigt knacka på spetsen för att tillåta lös förpackning av pulver i spetsens smala ände. Men om pulvret packas för hårt fastnar de i spetsen och kan inte spridas ordentligt. Det rekommenderas att neutralisera de statiska laddningarna av pulvret och pipettspetsen för att underlätta pulverbelastnin…

Materials

BALB/c mouse			Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g
CleanCap Firefly Luciferase mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
Dry Powder Insufflator	PennCentury	Model DP-4M
Ketamine 10%	Alfasan International B.V.	NA
Light emitting diode (LED) torch	Unilite Internation	PS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)	Roquette	450001
Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL)	Labcon	1034-800-000
Nylon floss	Reach	30017050
One milliliter syringe without needle	Terumo	SS-01T
Optical fibre	Fibre Data	OMPF1000
PEG12KL4 peptide	EZ Biolab		(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2
Plastic Pasteur fine tip pipette	Alpha Labotatories	LW4061
Three-way stopcock	Braun	D201
Xylazine 2%	Alfasan International B.V.	NA
Zerostat 3 anti-static gun	MILTY	5036694022153