Enkelt kerner isolation er afhængig af dissociation og vaskemiddel-baserede permeabilisering af cellemembranen, trin, der har brug for optimering og er tilbøjelige til at indføre tekniske artefakter. Vi demonstrerer en vaske- og enzymfri protokol til hurtig isolering af intakte kerner direkte fra hele væv, hvilket giver kerner, der er egnede til enkelt-kerne RNA-seq (snRNA-Seq) eller ATAC-seq.
Høj-gennemløb transskriptionome og epigenome profilering kræver forberedelse af en enkelt celle eller enkelt kerner suspension. Forberedelse af suspensionen med intakt celle eller kerner indebærer dissociation og permeabilisering, trin, der kan indføre uønsket støj og uønskede skader. Især, visse celle-typer såsom neuroner er udfordrende at adskille i de enkelte celler. Derudover, permeabilisering af cellulære membran til at frigive kerner kræver optimering af trial-and-error, som kan være tidskrævende, arbejdskrævende og økonomisk nonviable. For at forbedre robustheden og reproducerbarheden af prøveforberedelse til sekvensering med høj gennemløb beskriver vi en hurtig enzym- og vaskemiddelfri kolonnebaseret kerneisolationsmetode. Protokollen muliggør effektiv isolering af kerner fra hele zebrafiskhjernen inden for 20 minutter. De isolerede kerner viser intakt nuklear morfologi og lav tilbøjelighed til at samle. Yderligere, flow cytometri tillader kerner berigelse og clearance af cellulære snavs til downstream ansøgning. Protokollen, som skal arbejde på blødt væv og dyrkede celler, giver en enkel og tilgængelig metode til prøveforberedelse, der kan anvendes til høj-throughput profilering, forenkle de trin, der kræves for en vellykket single-nuclei RNA-seq og ATAC-seq eksperimenter.
Encellede RNA-seq (scRNA-Seq) og ATAC-seq er alsidige værktøjer til at studere komplekse biologiske systemer ved encellede opløsning. De er bredt udnyttet til at definere celle undertyper og stater, gennetværk og til at vurdere cellulære heterogenitet. En forudsætning for at udføre scRNA-seq er forberedelsen af en enkelt celle suspension ved væv dissociation. På grund af variationen i den ekstracellulære matrixsammensætning og mekaniske egenskaber kræver individuelle væv optimering af dissociationsprotokollen til forberedelse af enkeltcellesuspension.
Dissociation af væv i enkelte celler indebærer typisk behandling med fordøjelsesenzymer, herunder kollagen, dispase eller trypsin, ved 37 °C1,2,3,4. Da transskriptionelle maskiner forbliver aktive ved 37 °C, kan enzymatisk dissociation introducere mRNA-udtryksartefakterog støj 5,6. Især kan langvarig inkubation fremkalde stress responsive gener og varmechok reaktion i en ikke-ensartet måde – fører til tekniske variabilitet i forsøget7.
En anden ulempe ved at generere en enkelt celle suspension er vanskeligheden ved at opnå levedygtige og intakte celle-typer med komplekse morfologier. Især neuroner, adipocytter og podocytter er udfordrende at isolere8,,9,,10,11. For eksempel, Wu og kolleger viste fraværet af glomerular podocytes i scRNA profiler fra en voksen mus nyre12. Lignende ikkeoptimale observationer er blevet foretaget vedrørende inddrivelse af indbyrdes forbundne neuroner frahjernevæv 8,13,14. Alt i alt kan dissociationsprotokoller indføre detektionsbias i retning af lettere at adskille celletyper, hvilket fører til en forvanskning af organets cellulære arkitektur.
For at overvinde den tekniske støj og bias, der blev indført under prøveforberedelse i scRNA-Seq., er isolering og profilering af kernen et attraktivt alternativ. Da nuklear morfologi er den samme mellem forskellige celletyper, omgår isolationen af kernerne spørgsmålet om at isolere intakte og levedygtige celler med komplekse morfologier. For eksempel, Wu og kolleger demonstreret vellykket profilering af glomerular podocytes med single-nucleus RNA-Seq. (snRNA-Seq.) af en voksen mus nyre, som manglede fra scRNA-Seq12. Interessant nok har sammenlignende undersøgelser mellem enkeltcelle- og enkeltpunkts-RNA-seq antydet et fald i induktion af stress- og varmechok-responsgener med snRNA-Seq12. Undersøgelserne tyder endvidere på en høj korrelation mellem de gener, der påvises ved de to metoder. Men, en nylig undersøgelse af humane mikroglia undladt at opdage genetisk aktivering i Alzheimers sygdom15. I visse sammenhænge er snRNA-Seq således et egnet alternativ til scRNA-Seq16,17. Derudover kan den nukleare isolation anvendes til encellede ATAC-Seq., der giver oplysninger om regionerne af åben kromatin i de enkelte celler.
Protokollen for kerneisolation omfatter tre vigtige trin: i) vaskemiddelbaseret lysis af cellemembran til frigivelse af kernen; ii) vævshomogenisering ved hjælp af en Dounce-homogenisator og iii) berigelse af kerner og fjernelse af celleaffald ved hjælp af gradientcentrifugation eller flowcytometri18,19,20,21,22. Blandt dette, de første to trin afhænger af vævstype og skal empirisk optimeret. Mildt rengøringsmiddel fører til delvis brud på cellemembranen og ineffektiv udtagning af kerner fravævet 23. På den anden side fører et højt niveau af vaskemiddel og hård homogenisering til brud på den nukleare membran ogderes tab 24,25. Bristede kerner yderligere tendens til at klumpe sammen og danne aggregater, som hvis ikke fjernet kan føre til artefakter i downstream profilering eksperiment.
For at omgå problemerne i forbindelse med optimering af vaskemiddel til nukleiisolation indfører vi en protokol for at isolere intakte kerner fra friske prøver ved hjælp af en vaskemiddelfri og spin-kolonnebaseret metode. Protokollen giver kerner fra hele orgel inden for 20 minutter, hvilket begrænser induktion af artefaktuel transskription. De isolerede kerner kan beriges med FACS til single-nuclei RNA-Seq. og ATAC-seq, hvilket giver en enkel og universel metode, der muliggør robust og reproducerbar høj-gennemløbsprofilering.
Profilering af transcriptome og epigenome på en enkelt celle opløsning har revolutioneret studiet af biologiske systemer. Undersøgelser ved opløsningen af en enkelt celle for et fast væv afhænger af dissociation af organet i individuelle celler eller kerner. Dissociation er en destruktiv procedure, der kan indføre tekniske artefakter, som kan forhindre udviklingen af en nøjagtig repræsentation af systemet5,6. For eksempel kan enzymatisk dissociation skade celler med komplekse morfologier, såsom neuroner eller podocytter, og kan fremkalde udtryk for stress og varmechokrespons gener 7,12. Desuden kan brug af vaskemiddel under afkoskning briste den nukleare membran og føre tilaggregering 23,25. Således er optimering af dissociation at opnå en enkelt celle eller kerner suspension af højeste kvalitet altafgørende for succes en høj-throughput profilering eksperimenter.
Her demonstrerer vi en vaskemiddel- og enzymfri kerneisolationsmetode, der tillader udvinding af intakte kerner fra zebrafiskhjerne på mindre end 20 minutter. Protokollen giver kerner med typisk morfologi og robust integritet (Figur 2). Fra en enkelt zebrafisk hjerne vejer 6 mg, protokollen giver i alt 60.000 kerner bestemmes af en hæmocytometer tæller. De isolerede kerner kan anvendes til flere downstream applikationer, herunder snRNA-seq, ATAC-seq og immunsinde. De isolerede kerner kan omfatte krydskontaminering fra cytoplasmatiske fraktioner, især fra komponenter af endoplasmic reticulum og mitokondrier. For høj-throughput profilering eksperimenter, clearance af cellulære vragrester, især mitokondrier, anbefales kraftigt. Flowcytometri (Figur 3) giver en farbar vej til rensning af kerner. Alternativt kan saccharosegradienten også anvendes til fjernelse af snavs.
Protokollen er blevet testet på mus skjoldbruskkirtlen (data ikke vist) og giver resultater svarende til zebrafisk hjernevæv. Samlet set giver protokollen en robust, reproducerbar og universel metode til forberedelse af enkelt kerneaffjedring, hvilket er med til at forenkle logistikken til eksperimenter med profilering med høj kapacitet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer af Dr. Sabine Costagliola og Singh lab for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS under Tilskud nummer 34772792 – MISU til S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |