Enda atomkärna isolering bygger på dissociation och tvättmedel-baserade permeabilisering av cellmembranet, steg som behöver optimering och är benägna att införa tekniska artefakter. Vi visar ett tvättmedel och enzym-fria protokoll för snabb isolering av intakt kärnor direkt från hela vävnaden, vilket ger kärnor lämpliga för single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) eller ATAC-seq.
Hög genomströmning transkriptom och epigenom profilering kräver beredning av en enda cell eller enstaka kärnor suspension. Beredning av suspensionen med intakt cell eller kärnor innebär dissociation och permeabilisering, steg som kan införa oönskat buller och oönskade skador. Särskilt, vissa celltyper såsom nervceller är utmanande att separera till enskilda celler. Dessutom, permeabilization av det cellulära membranet för att frigöra kärnor kräver optimering av trial-and-error, vilket kan vara tidskrävande, arbetsintensiva och ekonomiskt nonviable. För att öka robustheten och reproducerbarheten hos provberedning för sekvensering med hög genomströmning beskriver vi en snabb enzym- och tvättmedelsfri pelarbaserad kärnisoleringsmetod. Protokollet möjliggör effektiv isolering av kärnor från hela zebrafiskhjärna inom 20 minuter. De isolerade kärnorna visar intakt nukleär morfologi och låg benägenhet att aggregera. Vidare, flöde cytometri tillåter kärnor anrikning och clearance av cellulära skräp för nedströms tillämpning. Protokollet, som bör fungera på mjuka vävnader och odlade celler, ger en enkel och tillgänglig metod för provberedning som kan användas för hög genomströmning profilering, förenkla de steg som krävs för framgångsrika single-kärnor RNA-seq och ATAC-seq experiment.
Single-cell RNA-seq (scRNA-Seq) och ATAC-seq är mångsidiga verktyg för att studera komplexa biologiska system med encellig upplösning. De används allmänt för att definiera cell subtyper och tillstånd, gennätverk och att bedöma cellulär heterogenitet. En förutsättning för att utföra scRNA-seq är beredningen av en enda cell suspension genom vävnad dissociation. På grund av variationen i den extracellulära matrissammansättningen och mekaniska egenskaper kräver enskilda vävnader optimering av dissociationsprotokollet för beredning av single cell suspension.
Dissociation av vävnader till enstaka celler innebär vanligtvis behandling med matsmältningsenzymer, inklusive kollagen, dispase eller trypsin, vid 37 °C1,2,3,4. Eftersom transkriptionsmaskiner förblir aktiva vid 37 °C kan enzymatisk dissociation införa mRNA-uttrycksartefakter och buller5,6. Framför allt kan långvarig inkubation framkalla stressresponsiva gener och värmechocksrespons på ett ojämnt sätt – vilket leder till tekniska variationer i experimentet7.
En annan nackdel med att generera en enda cell suspension är svårigheten att få livskraftiga och intakta cell-typer med komplexa morfologier. I synnerhet är nervceller, adipocyter och podocyter utmanande att isolera8,,9,,10,11. Till exempel, Wu och kollegor visade avsaknaden av glomerular podocytes i scRNA profiler från en vuxen mus njure12. Liknande icke-optimala observationer har gjorts när det gäller återvinning av sammankopplade nervceller från hjärnvävnad8,,13,14. Sammanfattningsvis kan dissociation protokoll införa upptäckt bias mot lättare att separera cell-typer, vilket leder till en förvrängning av cellulära arkitektur av organet.
För att övervinna det tekniska brus och bias som infördes under provberedning i scRNA-Seq., isolering och profilering kärnan ger ett attraktivt alternativ. Eftersom nukleär morfologi är liknande mellan olika celltyper, isolering av kärnorna kringgår frågan om att isolera intakta och livskraftiga celler med komplexa morfologier. Till exempel visade Wu och kollegor framgångsrik profilering av glomerular podocytes med enkärnan RNA-Seq. (snRNA-Seq.) av en vuxen mus njure, som saknades från scRNA-Seq12. Spännande, jämförande studier mellan encelliga och enstaka kärnan RNA-seq har föreslagit en minskning av induktion av stress och värme-chock respons gener med snRNA-Seq12. Studierna tyder vidare på en hög korrelation mellan de gener som detekteras av de två metoderna. Emellertid, en nyligen genomförd studie på mänskliga mikroglia misslyckades med att upptäcka genetisk aktivering vid Alzheimers sjukdom15. Således i vissa sammanhang är snRNA-Seq ett lämpligt alternativ för scRNA-Seq16,17. Dessutom kan den nukleära isoleringen användas för encelliga ATAC-Seq., som ger information om regionerna av öppen kromatin inom enskilda celler.
Protokollet för kärnisolering omfattar tre huvudsteg: i) tvättmedelsbaserad lys av cellmembranet för att frigöra kärnan; ii) vävnadshomogenisering med hjälp av en Dounce-homogenisator. och iii) anrikning av kärnor och avlägsnande av cellskräp med hjälp av gradientcentrifugering eller flödescytometri18,,19,,20,,21,22. Bland detta beror de två första stegen på vävnadstypen och måste empiriskt optimeras. Milt rengöringsmedel leder till partiell bristning av cellmembran och ineffektiv hämtning av kärnor från vävnaden23. Å andra sidan leder hög tvättmedel och hård homogenisering till bristning av det nukleära membranet och deras förlust24,25. Brusten kärnor tenderar ytterligare att klumpa ihop sig och bilda aggregat, som om inte tas bort kan leda till artefakter i nedströms profilering experiment.
För att kringgå de frågor som rör tvättmedel optimering för kärnor isolering, introducerar vi ett protokoll för att isolera intakta kärnor från färska prover med hjälp av en detergent-free och spin-kolumn-baserad metod. Protokollet ger kärnor från hela organet inom 20 minuter, vilket begränsar induktion av artifactual transkription. De isolerade kärnorna kan berikas med FACS för single-nuclei RNA-Seq. och ATAC-seq, vilket ger en enkel och universell metod som möjliggör robust och reproducerbar höggenomströmningsprofilering.
Profilering av transkriptom och epigenom vid en encellig upplösning har revolutionerat studiet av biologiska system. Studier vid upplösningen av en enda cell för en fast vävnad beror på dissociation av organet i enskilda celler eller kärnor. Dissociation är ett destruktivt förfarande som kan införa tekniska artefakter, vilket kan förhindra utveckling av en korrekt representation av systemet5,6. Till exempel, enzymatisk dissociation kan skada celler med komplexa morfologier, såsom nervceller eller podocyter, och kan framkalla uttryck för stress och värme-chock respons gener7,12. Dessutom kan användning av tvättmedel under dissociation brista kärnmembranet och leda till aggregering23,25. Således, optimera dissociation för att få en enda cell eller kärnor suspension av högsta kvalitet är avgörande för framgången för hög genomströmning profilering experiment.
Här demonstrerar vi en tvättmedels- och enzymfri kärnisoleringsmetod som möjliggör extraktion av intakta kärnor från zebrafiskhjärna på mindre än 20 minuter. Protokollet ger kärnor med typisk morfologi och robust integritet (figur 2). Från en enda zebrafisk hjärna väger 6 mg, protokollet ger totalt 60.000 kärnor bestäms av en hemocytometer räkna. De isolerade kärnorna kan användas för flera nedströmsapplikationer, inklusive snRNA-seq, ATAC-seq och immunostaining. De isolerade kärnorna kan inkludera korskontaminering från cytoplasmatiska fraktioner, särskilt från komponenter av endoplasmatiska reticulum och mitokondrierna. För hög genomströmning profilering experiment, clearance av cellulära skräp, särskilt mitokondrierna, rekommenderas starkt. Flödescytometri (figur 3) ger ett lönsamt alternativ för rening av kärnor. Alternativt kan sackaros gradienten också användas för avlägsnande av skräp.
Protokollet har testats på mus sköldkörtel (data visas inte) och ger resultat som liknar zebrafish hjärnvävnad. Sammantaget ger protokollet en robust, reproducerbar och universell metod för förberedelse av single nucleus suspension, vilket hjälper till att förenkla logistiken för hög genomströmningsprofileringsexperiment.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar av Dr Sabine Costagliola och Singh lab för kommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöddes av Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS under Grant nummer 34772792 – MISU till S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |