Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación
Summary
Aquí, describimos un método para calentar blastocistos humanos vitrificados, cultivarlos a través del período de implantación in vitro, digerirlos en células individuales y recoger las células trofoblastas tempranas para su posterior investigación.
Abstract
La implantación humana, la aposición y adhesión a la epitelia superficial uterina y la posterior invasión del blastocisto en la decidua materna, es un evento biológico crítico pero enigmático que ha sido históricamente difícil de estudiar debido a limitaciones técnicas y éticas. La implantación se inicia mediante el desarrollo del trofctodermo al trofoblasto temprano y la posterior diferenciación en sublineaciones de trofoblastos distintos. La diferenciación aberrante temprana de trofoboblastos puede conducir a insuficiencia de implantación, patologías placentarias, anomalías fetales y aborto espontáneo. Recientemente, se han desarrollado métodos para permitir que los embriones humanos crezcan hasta el día 13 después de la fertilización in vitro en ausencia de tejidos maternos, un período de tiempo que abarca el período de implantación en humanos. Esto ha dado a los investigadores la oportunidad de investigar la implantación humana y recapitular la dinámica de la diferenciación de trofoblastos durante este período crítico sin confundir las influencias maternas y evitando obstáculos inherentes para estudiar los primeros eventos de diferenciación embrionaria in vivo. Para caracterizar diferentes sublines de trofoblastos durante la implantación, hemos adoptado métodos de cultivo extendidos bidimensionales (2D) existentes y desarrollado un procedimiento para digerir y aislar enzimáticamente diferentes tipos de células trofoblastas para ensayos posteriores. Los embriones cultivados en condiciones 2D tienen una morfología relativamente aplanada y pueden ser subóptales en el modelado de arquitecturas embrionarias tridimensionales in vivo (3D). Sin embargo, la diferenciación de trofoblastos parece verse menos afectada como lo demuestran los cambios previstos en la morfología y la expresión génica a lo largo de la cultura extendida. Diferentes sublineages de trofoblastos, incluyendo citotroblasto, sincitiotrofobia y trofoblasto migratorio pueden separarse por tamaño, ubicación y emergencia temporal, y utilizarse para una mayor caracterización o experimentación. La investigación de estas células trofoblastas tempranas puede ser fundamental para comprender la implantación humana, tratar patologías placentarias comunes y mitigar la incidencia de pérdida del embarazo.
Introduction
La implantación humana y la aparición de la placenta temprana son históricamente difíciles de investigar y permanecen en gran medida desconocidas porque los tejidos humanos son inaccesibles en esta etapa en la que el embarazo es clínicamente indetectable. Los modelos animales son inadecuados, ya que la placentación humana tiene sus propias características únicas en comparación con otros mamíferos euterianos. Por ejemplo, la placenta humana invade profundamente la decidua con algunas células trofoblastas que alcanzan al menos el tercio interno del miometrio uterino, mientras que otras células remodelan las arterias espirales uterinas. Incluso nuestros ancestros evolutivos más cercanos, los primates no humanos, muestran diferencias en la morfología placentaria y las interacciones trofoblastas con los tejidos deciduales maternos1,,2,,3. La obtención de embriones humanos preimplantacionales in vitro no fue posible hasta que en la década de 1980, cuando la fecundación in vitro humana clínica (FIV) comenzó como una práctica rutinaria para el tratamiento de la infertilidad4. Ahora, los blastocistos humanos se pueden cultivar in vitro para permitir la selección de embriones más viables para la transferencia, así como para permitir pruebas genéticas seguras. La mejora de las técnicas de cultivo de embriones, así como el uso cada vez mayor de la FIV ha producido muchos blastocistos excedentes que permanecen después de que se hayan completado los ciclos de tratamiento del paciente. Con el consentimiento del paciente, la aprobación del IRB, y con ciertas restricciones, estos blastocistos pueden ser utilizados para estudios de investigación. Se han convertido en un recurso invaluable que se utilizaron para la derivación de células madre embrionarias humanas5, la comprensión de la transición de la masa celular interna a las células madre embrionarias6,,7,y más recientemente, se han cultivado con éxito hasta el día (D) 13 para remodelar la implantación humana8,,9. Mediante la utilización de enfoques omics de células únicas desarrollados recientemente, el acceso a estos tejidos embrionarios humanos en etapas de implantación ha ofrecido oportunidades únicas para describir los mecanismos moleculares que regulan este proceso de diferenciación celular altamente dinámico, que antes eran imposibles de explorar10,,11,,12,,13.
Aquí, describimos los métodos utilizados en nuestra reciente publicación que caracteriza la dinámica de la diferenciación de trofoblastos durante la implantación humana12. Este protocolo incluye el calentamiento de blastocistos vitrificados, el cultivo de embriones extendido hasta D12 después de la FIV, la digestión enzimática del embrión en células individuales y la recolección celular para ensayos posteriores (Figura 1). Este sistema de cultivo extendido apoya el desarrollo embrionario humano en etapa periimplantacional sin aportes maternos y recapitula la diferenciación trofoblasta que parece coherente con las observaciones hechas de especímenes histológicos hace muchos años14,,15,,16,,17. Durante la implantación, la población de trofoblastos se compone de al menos dos tipos de células: el citotrofoblasto mononucleado similar a un progenitor (CTB) y el sintiotrofoboque multinucleado diferenciado terminalmente (STB). Tras la digestión de la trippsina, las CTB son células pequeñas y redondas que son morfológicamente indistinguibles de otros linajes celulares(Figura 2A,panel izquierdo). La separación de CTB de otros linajes celulares, como el epíblasto y el endodermo primitivo, se puede lograr mediante sus distintos perfiles transcriptómicos revelados por la secuenciación de ARN de una sola célula. Las células de sincitiotrofoblastos se pueden identificar fácilmente como estructuras de forma irregular que son significativamente más grandes que los otros tipos de células y se encuentran principalmente en la periferia del embrión (Figura 2A,panel medio; Figura 2B, panel izquierdo). Las células trofoblastas migratorias (MTB) son otro sublineaje trofoblasto encontrado durante el cultivo extendido embrionario y pueden reconocerse como aparentemente alejarse del cuerpo principal del embrión(Figura 2A,panel derecho, Figura 2B,panel derecho). El trofoblasto migratorio, aunque expresa muchos de los mismos marcadores que el trofoblasto villoso extra (EVT), no debe denominarse EVT, ya que las estructuras villosas de la placenta no han surgido en esta etapa muy temprana de desarrollo.
Experimentalmente, pudimos recoger pequeños CTB y STB grandes que son fácilmente distinguibles después de que los embriones se digieren en células individuales en D8, D10 y D12(Figura 2A,B). Los trofoblastos migratorios surgen en las etapas posteriores del cultivo embrionario prolongado y se pueden recoger en D12 antes de la digestión enzimática de todo el embrión (Figura 2A,B). Al separar fenotípicamente estos tres sublines trofoblastos antes del análisis de una sola célula, podemos identificar marcadores transcriptómicos específicos y definir el papel biológico de cada tipo de célula. Citotrofoblast son altamente proliferativos y actúan como células progenitoras en el suministro de los linajes diferenciados STB y MTB10,,11,12,,13. Syncytiotrophoblast está implicado en la producción de hormonas placentarias para mantener el embarazo y también puede ser responsable de los embriones que se entierran en el endometrio10,11,12,13. El trofoblasto migratorio tiene características aún más fuertes de un fenotipo invasor, migratorio y es probable que sea responsable de una colonización más profunda y extensa del endometrio uterino10,,11,,12,,13. Después de definir la firma transcriptómica de cada tipo de célula, los análisis de agrupación en clústeres también han revelado dos subconjuntos adicionales de células que eran morfológicamente indistinguibles de CTB y tenían transcriptomas con características de STB y MTB, respectivamente12. Es probable que estas células de estadio intermedio se dilecen de CTB a los sublineages MTB o STB y se habrían pasado por alto si los embriones se digieren ciegamente y las células estuvieran separadas por transcriptoma solo.
El protocolo descrito aquí utiliza un sistema de cultivo bidimensional (2D) y puede no ser óptimo para apoyar el desarrollo estructural tridimensional (3D), como sugiere una publicación reciente que describe un sistema de cultivo 3D recién desarrollado13. Sin embargo, en este sistema 2D la diferenciación del trofoblasto temprano parece ser consistente con las observaciones hechas de especímenes in vivo14,,15,,16,,17. Este protocolo también se puede adaptar fácilmente para su uso en el sistema de cultivo 3D13 recientemente descrito con cambios mínimos. Todos los pasos se llevan a cabo con una pipeta de micromanipulación de mano con puntas desechables disponibles comercialmente o una pipeta de boca de una pipeta de vidrio finamente tirada unida a tubos de goma, un filtro y una boquilla.
Protocol
Representative Results
Discussion
El desarrollo del protocolo para el cultivo de embriones humanos a través de la implantación ha permitido a los científicos explorar un tiempo previamente desconocido en el desarrollo8,,9. Aquí, utilizamos un sistema de cultivo extendido para cultivar embriones humanos y estudiar la diferenciación temprana de trofobos antes de la formación de placenta villosa. Los métodos descritos aquí nos permiten recopilar diferentes sublineaciones de TB para su uso en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer a los muchos pacientes del Centro de Medicina Reproductiva de Colorado (CCRM) que han donado amablemente sus embriones para la investigación. También queremos agradecer a Karen Maruniak y al laboratorio clínico de CCRM por su ayuda en el procesamiento de muestras de hCG, así como a Sue McCormick y su equipo clínico de embriología de FIV en CCRM por su ayuda con la recolección, almacenamiento, seguimiento y donación de embriones. La financiación fue proporcionada internamente por el CCRM.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
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