यहां हम मिडब्रेन न्यूरॉन्स में इन विट्रो Ca2 + फ्लक्स को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और प्राथमिक माउस मिडब्रेन संस्कृतियों का उपयोग करके कैस्पास-3 पर उनके डाउनस्ट्रीम प्रभाव। इस मॉडल को मिडब्रेन न्यूरॉन्स में असामान्य सीए2 + गतिविधि से संबंधित रोगोफिजियोलॉजिक परिवर्तनों का अध्ययन करने और एंटी-एपोटोटिक गुणों के लिए उपन्यास चिकित्सीय को स्क्रीन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
पार्किंसंस रोग (पीडी) डोपामिनेर्गिक (डीए) न्यूरॉन्स के पतन के कारण एक विनाशकारी न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है। ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की असामान्य सक्रियता के कारण अत्यधिक सीए2 + आमद डीए एक्सेक्टॉक्सिकिटी में परिणाम है और डीए न्यूरॉन हानि के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र के रूप में पहचान की गई है। इस अध्ययन में, हम ED14 माउस भ्रूण के माउस वेंट्रल मेसेंसेफेलन (वीएम) से मिडब्रेन न्यूरॉन्स को अलग, अलग और संस्कृति मिडब्रेन न्यूरॉन्स करते हैं। फिर हम मानव न्यूरॉन-विशिष्ट सिनैप्सिन प्रमोटर, एचएसएन के नियंत्रण में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक, GCaMP6f व्यक्त करने वाले एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के साथ दीर्घकालिक प्राथमिक माउस मिडब्रेन संस्कृतियों को संक्रमित करते हैं। लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके, हम बताते हैं कि सुसंस्कृत माउस मिडब्रेन न्यूरॉन्स एएवी-एचएसएन-जीसीएएमपी 6एफ द्वारा पता किए गए सहज सीए2 + फ्लक्स प्रदर्शित करते हैं। मिडब्रेन संस्कृतियों के लिए ग्लूटामेट के स्नान आवेदन न्यूरॉन्स के भीतर इंट्रासेल्युलर सीए2 + में असामान्य ऊंचाई का कारण बनता है और यह दा न्यूरॉन्स में कैस्पास-3 सक्रियण के साथ होता है, जैसा कि इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। प्राथमिक माउस दा न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस की पहचान करने की तकनीकों में डीए न्यूरॉन स्वास्थ्य को संरक्षित करने वाली दवाओं की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण अनुप्रयोग हैं।
पार्किंसंस रोग (पीडी) दुनिया भर में दूसरा सबसे आम न्यूरोडीजेनेरेटिव डिसऑर्डर है, जिसमें कोई ज्ञात इलाज नहीं है। अनुमान ों से पता चलता है कि पीडी की व्यापकता में वृद्धि जारी रहेगी औरअकेलेसंयुक्त राज्य अमेरिका में वर्ष 2030 तक 1 मिलियन निदानों को पार करने का अनुमान है । पीडी का मुकाबला करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध कुछ प्रभावी उपचारों के साथ, अधिक प्रभावी उपचार विकसित करने की आवश्यकता है। पीडी मिडब्रेन डोपामाइन (डीए) न्यूरॉन्स2के एक तेजी से और प्रगतिशील नुकसान की विशेषता है । पीडी में न्यूरोडिजेनरेशन को रेखांकित करने वाले तंत्र खराब समझ में आते हैं। साक्ष्य कई तंत्रों के संभावित अभिसरण का सुझाव देते हैं, जैसे ऑक्सीडेटिव तनाव और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, आदि जो एपोटोटिक सिग्नलिंग कैस्केड और अंतिम सेल डेथ3की शुरुआत में योगदान देते हैं।
ऐसा ही एक अभिसरण तंत्र, ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्ससिटॉक्सिकिटी को पीडी4सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में फंसाया गया है । जबकि ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सेक्टॉक्सिकिटी को मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर सीए2 + एकाग्रता और एपोप्टोसिस की अंतिम शुरुआत में अत्यधिक वृद्धि के माध्यम से एनएमडीए रिसेप्टर्स की उत्तेजना के माध्यम से काम करने के लिए सोचा जाता है, सीए,2 +-पारगम्य एम्पा रिसेप्टर्स को भी एक्सिटोटॉक्सिक प्रतिक्रिया5,,6,7में फंसाया गया है। इसलिए, पीडी मॉडल के भीतर ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस में एम्पा रिसेप्टर्स के योगदान को निर्धारित करना रुचि है। यह NBQX, एक AMPA और काइनेट अवरोधक का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो माइक्रोमोलर सांद्रता पर एम्पा रिसेप्टर्स8के लिए चयनात्मक है। ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सटॉक्सिकिटी और एपोप्टोटिक सिग्नलिंग कैस्केड सेल मृत्यु की सीमा को मापने के लिए एक आदर्श डाउनस्ट्रीम लक्ष्य हैं, और चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक संभावित लक्ष्य है। इसलिए, कैल्शियम गतिविधि के ग्लूटामेट-मध्यस्थता मॉड्यूलेशन का आकलन करने और प्राथमिक वेंट्रल मेसेफेलिक (वीएम) न्यूरॉन्स में जुड़े डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए एक उच्च सामग्री विधि विकसित करना न्यूरोनल स्वास्थ्य को संरक्षित करने की उनकी क्षमता पर उपन्यास उपचार विधियों की स्क्रीनिंग के लिए मूल्यवान होगा।
यहां, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसमें हम आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर (जीईसीआई), GCaMP6f को व्यक्त करते हैं, जो ग्लूटामेट आवेदन के जवाब में माउस वीएम प्राथमिक न्यूरॉन्स की सीए2 + गतिविधि को मापने के लिए मानव सिनैपिन (एचएसएन) प्रमोटर के साथ AAV2/5 का उपयोग करके व्यक्त करते हैं जिसे शारीरिक और आणविक स्तर पर मापा जा सकता है। इस उच्च सामग्री स्क्रीनिंग फार्मास्यूटिकल्स या उपचार है कि Ca2 + गतिविधि मिलाना वीएम न्यूरॉन्स के स्वास्थ्य को बनाए रखने की खोज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हम प्रस्ताव करते हैं कि यह प्राथमिक संस्कृति मॉडल उपन्यास पीडी हस्तक्षेपों के लिए स्क्रीन करने का एक प्रभावी तरीका है, जो वीएम न्यूरॉन्स के स्वास्थ्य को संरक्षित करने और पीडी की प्रगति को कम करने की उनकी क्षमता के आधार पर है।
हम न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस के उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए दीर्घकालिक प्राथमिक वेंट्रल मेसेंसेफेलिक (वीएम) सेल कल्चर सिस्टम का वर्णन करते हैं। अध्ययनों ने पीडी मॉडल11 , 12,के संदर्भ में उत्तेजोटॉक्सिक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए प्राथमिक मिडब्रेन डोपामिनेर्गिक संस्कृतियों कोनियोजितकिया है । इस अध्ययन में, हम सीए2 + गतिविधि को मापने के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) का उपयोग करके एक संयोजन दृष्टिकोण को नियोजित करते हैं और इस गतिविधि को डाउनस्ट्रीम आणविक परिवर्तनों के साथ जोड़ते हैं, जैसे कि एपोप्टोटिक सिग्नलिंग कैस्केड4की शुरुआत। विधि अन्य समान सेल संस्कृति प्रणालियों के लिए कई फायदे हैं। जैसा कि हम पार्किंसंस रोग के संदर्भ में excitoxicity में विशेष रुचि है, प्राथमिक VM सेल संस्कृतियों का उपयोग आदर्श है । विभिन्न क्षेत्र स्थानांतरण तकनीकों का उपयोग करके, जैसे कि ग्रिड्ड कवरस्लिप या एक मोटराइज्ड XY माइक्रोस्कोप चरण TH इम्यूनोस्टेपिंग के साथ संयुक्त, हम सीधे वेंट्रल मिडब्रेन न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस के सेल प्रकार विशिष्ट प्रभावों का अध्ययन कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, 3 सप्ताह के सेल संस्कृति मॉडल न्यूरॉन्स के लिए अपने पूर्ण, परिपक्व आणविक प्रोफ़ाइल विकसित करने के लिए अनुमति देता है, वयस्क दा न्यूरॉन्स9को दर्शाती है । पिछले तरीकों में मुख्य रूप से ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सटॉक्सिकिटी13,14के बाद आणविक परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित किया गया है। मॉडल की पहचान की कोशिका प्रकार में डाउनस्ट्रीम आणविक घटनाओं के साथ न्यूरोनल शरीर विज्ञान में तीव्र परिवर्तन सहसंबंधित करने की क्षमता में अद्वितीय है । प्राथमिक संस्कृति मॉडल की एक सीमा यह है कि विच्छेदन तकनीक डीए और गाबेर्गिक न्यूरॉन्स के साथ-साथ एसएनसी और वीटीए के न्यूरॉन्स सहित पूरे वेंट्रल मिडब्रेन को कैप्चर करती है। अब साक्ष्य से पता चलता है कि एसएनसी के डीए न्यूरॉन्स में पड़ोसी वीटीए15के डीए न्यूरॉन्स की तुलना में कैल्शियम और अंतिम कोशिका मृत्यु के लिए चयनात्मक भेद्यता है । दुर्भाग्य से, भ्रूणीय संस्कृतियों में वीटीए न्यूरॉन्स से एसएनसी अंतर भ्रूणीय मस्तिष्क में इन संरचनाओं को परिभाषित करने के लिए कुछ शारीरिक स्थलों के साथ मुश्किल साबित हुआ है।
हम प्रदर्शित करते हैं कि प्राथमिक संस्कृति तकनीक विषम सहज सीए2 + गतिविधि(चित्रा 1)के मात्राकरण के लिए अनुमति देती है। इसलिए, यह एक आदर्श कोशिका संस्कृति प्रणाली मॉडल है जो टोनिक रूप से सक्रिय कोशिकाओं का अध्ययन करता है, जैसे कि मिडब्रेन के पेसमेकिंग डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स, नियोकॉर्टिकल न्यूरॉन्स, और सुपर्राचियामैटिक न्यूक्लियस (एससीएन)16, 17,17के गाबएर्गिक न्यूरॉन्स। अधिकांश अनुप्रयोगों में, सीए2 + इमेजिंग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के समान लौकिक संकल्प को प्राप्त नहीं करता है। इसलिए, यह संभावना है कि एक भी सीए2 + घटना न्यूरोनल एक्शन क्षमता के फटने के अनुरूप है। इसका मतलब यह समझा जा सकता है कि सीए2 + इमेजिंग पेसमेकिंग कोशिकाओं में असामान्य फोड़ गतिविधि के अपेक्षाकृत सटीक उपायों के लिए अनुमति देता है और इसलिए सीए2 +-मध्यस्थताएक्सिटोटॉक्सिक सेल मृत्यु की उच्च सामग्री स्क्रीन के लिए उपयुक्त है।
सहज Ca2+ गतिविधि को प्राप्त करने और बनाए रखने के लिए, प्रोटोकॉल में दो प्रमुख बिंदुओं को संबोधित करना महत्वपूर्ण है। सबसे पहले विच्छेदन के बाद कोशिकाओं का चढ़ाना घनत्व है। प्राथमिक वीएम न्यूरॉन्स के लिए, पिछले अध्ययनों में लगभग 100,000 कोशिकाओं/29,10 हमने प्रोटोकॉल को 200,000 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व को प्लेट करने के लिए अनुकूलित किया है, जो सहज गतिविधि की एक विषम रेंज बनाता है और प्रत्येक कवरस्लिप पर मौजूद डोपामिनेर्गिक वीएम न्यूरॉन्स की संख्या बढ़ाता है। चूंकि विभिन्न पेसमेकिंग न्यूरॉन्स में अलग-अलग फायरिंग गुण16होते हैं, इसलिए सहज गतिविधि के आदर्श स्तर को प्राप्त करने के लिए प्लेटिंग घनत्व को सेल प्रकार के अध्ययन और अनुकूलित करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। दूसरा AAVs के वायरल संक्रमण के बाद इनक्यूबेशन बार है । चढ़ाना घनत्व की तरह, यह अनुसंधान प्रश्न और AAV के प्रकार के विशिष्ट संदर्भ पर निर्भर किया जा रहा है इस्तेमाल किया जा रहा है । यहां उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट एएवी के लिए, वायरल संक्रमण के बाद इनक्यूबेशन के 5 दिन वांछित प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए आदर्श हैं, जो सीए2 + गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए GCaMP फ्लोरेसेंस में गतिशील परिवर्तनों की अनुमति देता है। कई कारक यह निर्धारित करते हैं कि एक एएवी अपने कार्गो को कितनी जल्दी और कुशलता से व्यक्त करेगा, जिनमें से अधिकांश इस विधि के दायरे से बाहर है, लेकिन संक्षेप में, प्रमोटर गतिविधि और उस दर पर विचार करना महत्वपूर्ण है जिस पर कार्गो प्रोटीन परिपक्व और सिलवटों।
विधि का एक और लाभ यह है कि यह प्रारूप, अभिव्यक्ति वैक्टर, इमेजिंग उपकरण के उपयोग, और वैज्ञानिक प्रश्नों की सीमा में काफी लचीलेपन की अनुमति देता है जिसे संबोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, विधि विशिष्ट प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला में जांच को सक्षम बनाती है जो पीडी में ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सिटॉक्सिटी और तंत्रिका तंत्र की शिथिलता के अन्य मॉडलों को घेरे हुए हैं। उदाहरण के लिए, ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्ससिटॉक्सिटी में कई रिसेप्टर्स और सिग्नलिंग कैस्केड5शामिल हैं। विधि का उपयोग करके, और जैसा कि चित्रा 1में एएमपीएआर अवरोधक, एनबीक्यूएक्स के साथ प्रदर्शित किया गया है, शारीरिक और आणविक स्तर पर एक्सिटोक्सिक ग्लूटामेट प्रतिक्रिया के विशिष्ट घटकों को काटना संभव है। क़यास, दूसरे दूत प्रणालियों के अवरोधकों का उपयोग करके एक समान दृष्टिकोण का उपयोग उनके योगदान को उत्तेजित करने के लिए निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यहां उपयोग किए जाने वाले एएवी को सेल-विशिष्ट प्रमोटरों या एएवी-व्यक्त ऑप्टोजेनेटिक सेंसर के साथ जीईसीआई व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिसका उपयोग न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज जैसे अन्य मापदंडों को मापने के लिए किया जा सकता है।
प्राथमिक भ्रूणीय विच्छेदन और कॉन्फोकल इमेजिंग के अलावा, अधिकांश प्रोटोकॉल बुनियादी प्रयोगशाला कौशल का उपयोग करता है जिन्हें विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, मॉडल की सीमाओं में भ्रूण विच्छेदन तकनीक की कठिनाई शामिल है, कोशिकाओं को परिपक्वता तक पहुंचने के लिए सुसंस्कृत किया जाना चाहिए, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, या इसी तरह के इमेजिंग उपकरण तक पहुंच। विधि के कई लाभ और लचीलापन इन सीमाओं से अधिक है, जिससे तंत्रिका तंत्र विकारों में भूमिका ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सटॉक्सिकिटी का अध्ययन करने के लिए यह एक आदर्श मॉडल है। अंत में, यह मॉडल एंटी-एपोप्टोटिक प्रभावों और डीए न्यूरॉन स्वास्थ्य को संरक्षित करने की उनकी क्षमता के लिए उपन्यास यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
अमेरिकन पार्किंसंस डिजीज एसोसिएशन (एपीडीए) और एनआईएच आर01एनएस115809-01 से अनुदान द्वारा समर्थित रुपये । हम प्राथमिक डोपामिनेर्गिक संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए समय पर गर्भवती चूहों को उपलब्ध कराने के लिए टेक्सास ए एंड एम इंस्टीट्यूट फॉर जीनोमिक मेडिसिन (TIGM) का शुक्रिया अदा करते हैं।
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |