Her presenterer vi en protokoll for å måle in vitro Ca2 + fluxes i midbrain nevroner og deres nedstrøms effekter på caspase-3 ved hjelp av primær mus midbrain kulturer. Denne modellen kan brukes til å studere patofysiologiske endringer knyttet til unormal Ca2 + aktivitet i midbrain nevroner, og for å screene nye terapeutiske midler for anti-apoptotiske egenskaper.
Parkinsons sykdom (PD) er en ødeleggende nevrodegenerativ lidelse forårsaket av degenerasjon av dopaminerge (DA) nevroner. Overdreven Ca2 + tilstrømning på grunn av unormal aktivering av glutamatreseptorer resulterer i DA excitotoxicity og har blitt identifisert som en viktig mekanisme for DA neuron tap. I denne studien isolerer vi, dissosierer og kultur midbrain nevroner fra musen ventral mesencephalon (VM) av ED14 mus embryoer. Vi smitter deretter de langsiktige primære musemidbrainkulturene med et adeno-assosiert virus (AAV) som uttrykker en genetisk kodet kalsiumindikator, GCaMP6f under kontroll av den menneskelige nevronspesifikke synapsinarrangøren, hSyn. Ved hjelp av live confocal imaging viser vi at kultiverte musemidbrainnevroner viser spontane Ca2 + flukser oppdaget av AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath anvendelse av glutamat til midbrain kulturer forårsaker unormale økninger i intracellulær Ca2 + i nevroner og dette er ledsaget av caspase-3 aktivering i DA nevroner, som demonstrert ved immunostaining. Teknikkene for å identifisere glutamat-mediert apoptose i primær mus DA nevroner har viktige anvendelser for høyt innhold screening av legemidler som bevarer DA neuron helse.
Parkinsons sykdom (PD) er den nest vanligste nevrodegenerative lidelsen over hele verden, uten kjent kur. Estimater tyder på at PD-utbredelsen vil fortsette å øke og forventes å overgå 1 million diagnoser innen år 2030 i USA alene1. Med få effektive behandlinger som for tiden er tilgjengelige for å bekjempe PD, er det et presserende behov for å utvikle mer effektive terapier. PD er preget av et raskt og progressivt tap av midbrain dopamin (DA) nevroner2. Mekanismene som ligger til grunn for nevrodegenerasjon i PD er dårlig forstått. Bevis tyder på en sannsynlig konvergens av flere mekanismer, som oksidativt stress og mitokondriedysfunksjon, etc. som bidrar til initiering av apoptotiske signalkaskader og eventueltcelledød 3.
En slik konvergent mekanisme, glutamat-mediert excitotoxicity har vært innblandet i flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert PD4. Mens glutamat-mediert excitotoxicity antas å fungere hovedsakelig gjennom stimulering av NMDA reseptorer via en overdreven økning i intracellulær Ca2 + konsentrasjon og eventuell initiering av apoptose, Ca2 +-permeable AMPA reseptorer har også vært innblandet i eksoksikoksiøs respons5,6,7. Derfor er det av interesse å bestemme bidraget fra AMPA-reseptorer til glutamat-mediert apoptose i en PD-modell. Dette kan oppnås ved hjelp av NBQX, en AMPA og kainate blokkering, som ved mikromolarkonsentrasjoner er selektiv for AMPAreseptorer 8. Glutamat-mediert excitotoxicity og apoptotiske signalkaskader er et ideelt nedstrøms mål for å måle omfanget av celledød, og et potensielt mål for terapeutisk intervensjon. Derfor, utvikle en høyinnhold metode for å vurdere glutamat-mediert modulering av kalsiumaktivitet og tilhørende nedstrøms signalering i primære ventral mesencephalic (VM) nevroner ville være verdifull for screening nye behandlingsmetoder på deres evne til å bevare nevronal helse.
Her har vi utviklet en protokoll der vi uttrykker den genetisk kodede kalsiumindikatoren (GECI), GCaMP6f, ved hjelp av AAV2/5 med den menneskelige synapsin (hSyn) promotor for å måle Ca2 + aktiviteten til mus VM primære nevroner som svar på glutamat applikasjon som kan måles på fysiologisk og molekylært nivå. Denne høyinnholdsscreeningen kan tilpasses for å oppdage legemidler eller behandlinger som modulerer Ca2 + aktivitet for å bevare helsen til VM-nevroner. Vi foreslår at denne primære kulturmodellen er en effektiv måte å screene for nye PD-intervensjoner, basert på deres evne til å bevare helsen til VM-nevroner og redusere utviklingen av PD.
Vi beskriver et langsiktig primært ventral mesencephalic (VM) cellekultursystem for analyse av høyt innhold av glutamat-mediert apoptose i nevroner. Studier har brukt primære midbrain dopaminerge kulturer for å belyse eksoksiske mekanismer i sammenheng medPD-modeller 11,12. I denne studien bruker vi en kombinatorisk tilnærming ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) for å måle Ca2 + aktivitet og videre knytte denne aktiviteten til nedstrøms molekylære endringer, for eksempel initiering av apoptotiske signalkaskader4. Metoden har flere fordeler med andre lignende cellekultursystemer. Som vi har spesiell interesse for excitotoxicity i sammenheng med Parkinsons sykdom, ved hjelp av primære VM cellekulturer er ideelt. Ved å bruke ulike feltflyttingsteknikker, for eksempel gridded coverslips eller et motorisert XY-mikroskopstadium kombinert med TH-immunstaining, kan vi direkte studere celletypenspesifikke effekter av glutamatmediert apoptose i ventrale midbrainnevroner. I tillegg gjør den 3-ukers cellekulturmodellen det mulig for nevroner å utvikle sin fulle, modne molekylære profil, noe som gjenspeiler voksne DA-nevroner9. Tidligere metoder har hovedsakelig fokusert på molekylære endringer etter glutamat-mediert excitotoxicity13,14. Modellen er unik i sin evne til å korrelere akutte endringer i nevronal fysiologi med nedstrøms molekylære hendelser i identifiserte celletyper. En begrensning av den primære kulturmodellen er at disseksjonsteknikken fanger hele ventrale midbrain, inkludert DA og GABAergic nevroner samt nevroner fra SNc og VTA. Bevis tyder nå på at DA nevroner av SNc har selektiv sårbarhet for kalsium og eventuell celledød sammenlignet med DA nevroner av nabo VTA15. Dessverre har differensiering av SNc fra VTA-nevroner i embryonale kulturer vist seg vanskelig med få anatomiske landemerker for å definere disse strukturene i den embryonale hjernen.
Vi viser at den primære kulturteknikken tillater kvantifisering av heterogen spontan Ca2 + aktivitet (figur 1). Derfor er dette en ideell cellekultursystemmodell for å studere tonisk aktive celler, for eksempel pacemaking dopaminerge nevroner i midbrain, neokortikale nevroner og GABAergiske nevroner i suprachiasmatic kjernen (SCN)16,17. I de fleste applikasjoner oppnår ca2 + bildebehandling ikke samme temporal oppløsning som elektrofysiologi. Derfor er det sannsynlig at en enkelt Ca2 + hendelse er analog med et utbrudd av nevronale virkningspotensialer. Dette kan tolkes slik at Ca2 + bildebehandling gir mulighet for relativt nøyaktige målinger av unormal sprengningsaktivitet i pacemaking celler og er derfor egnet for en høyinnholdsskjerm av Ca2 +-mediert eksoksisk celledød.
For å oppnå og opprettholde spontan Ca2 + aktivitet, er det viktig å ta opp to viktige punkter i protokollen. Først er plating tettheten av cellene etter disseksjon. For primære VM nevroner, tidligere studier har brukt rundt 100.000 celler/cm29,,10. Vi har tilpasset protokollen til plate en tetthet på 200.000 celler / cm2, noe som skaper et heterogent spekter av spontan aktivitet og øker antall dopaminerge VM nevroner tilstede på hver coverlip. Siden ulike pacemaking nevroner har forskjellige avfyring egenskaper16, plating tetthet må tilpasses celletypen blir studert og optimalisert for å oppnå ideelle nivåer av spontan aktivitet. For det andre er inkubasjonstiden etter virusinfeksjon av AAVs. Som plating tetthet, dette vil være avhengig av den spesifikke konteksten av forskningsspørsmålet og type AAV som brukes. For den spesifikke AAV brukes her, 5 dager med inkubasjon etter virusinfeksjon er ideell for å oppnå ønsket protein uttrykk nivåer, som gjør det mulig for dynamiske endringer i GCaMP fluorescens for å registrere Ca2 + aktivitet. Mange faktorer bestemmer hvor raskt og effektivt en AAV vil uttrykke sin last, hvorav mye er utenfor omfanget av denne metoden, men kort er det viktig å vurdere arrangøraktivitet og hastigheten som lastproteinet modnes og bretter seg.
En annen fordel med metoden er at den gir betydelig fleksibilitet i format, uttrykksvektorer, bruk av bildeutstyr og utvalget av vitenskapelige spørsmål som kan tas opp. I tillegg gjør metoden det mulig å granske et bredt spekter av spesifikke spørsmål som omgir glutamat-mediert spenning i PD, og andre modeller av nervesystemet dysfunksjon. Glutamat-mediert eksitoksisitet innebærer for eksempel flere reseptorer og signaliserer kaskader5. Ved å bruke metoden, og som demonstrert med AMPAR-blokkeringen, NBQX i figur 1,er det mulig å dissekere ut spesifikke komponenter i den eksoksiske glutamatresponsen på fysiologisk og molekylært nivå. Tenkelig, en lignende tilnærming ved hjelp av hemmere av andre messenger systemer kan brukes til å bestemme deres bidrag til excitotoxicity. I tillegg kan AAVs som brukes her tilpasses for å uttrykke GECIer med cellespesifikke arrangører eller AAV-uttrykte optogenetiske sensorer som kan brukes til å måle andre parametere som nevrotransmitterutgivelse.
Bortsett fra primære embryonale disseksjoner og konokkal avbildning, bruker mye av protokollen grunnleggende laboratorieferdigheter som ikke krever spesialisert opplæring. Derfor inkluderer begrensningene til modellen vanskeligheten med den embryonale disseksjonsteknikken, hvor lenge cellene må dyrkes for å nå modenhet, og tilgang til et konokkalt mikroskop eller lignende bildeapparat. De mange fordelene og fleksibiliteten ved metoden oppveier disse begrensningene, noe som gjør dette til en ideell modell for å studere rollen glutamat-mediert excitotoxicity i nervesystemet lidelser. Til slutt kan denne modellen være et effektivt verktøy for å screene nye forbindelser for anti-apoptotiske effekter og deres evne til å bevare DA neuron helse.
The authors have nothing to disclose.
Støttet av tilskudd fra American Parkinson Disease Association (APDA) og NIH R01NS115809-01 til RS. Vi takker Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) for å gi tidsbevisste gravide mus for å generere primære dopaminerge kulturer.
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |