Oxygen-induceret retinopati Model for iskæmiske retinale sygdomme hos gnavere
Summary
Oxygen-induceret retinopati (OIR) kan bruges til at modellere iskæmiske nethindesygdomme såsom retinopati af prematurity og proliferativ diabetisk retinopati og til at tjene som model for proof-of-concept undersøgelser i evalueringen af antiangiogene lægemidler til neovaskulære sygdomme. OIR fremkalder robust og reproducerbar neovascularisering i nethinden, der kan kvantificeres.
Abstract
En af de almindeligt anvendte modeller for iskæmiske retinopatier er den ilt-inducerede retinopati (OIR) model. Her beskriver vi detaljerede protokoller for OIR-modellens induktion og dens udlæsninger hos både mus og rotter. Retinal neovascularisering induceres i OIR ved at udsætte gnaverunger enten for hyperoxi (mus) eller vekslende niveauer af hyperoxi og hypoxi (rotter). De primære udlæsninger af disse modeller er størrelsen af neovaskulære (NV) og avascular (AVA) områder i nethinden. Denne prækliniske in vivo-model kan bruges til at evaluere effekten af potentielle antiangiogene lægemidler eller til at adressere specifikke geners rolle i nethindens angiogenese ved hjælp af genetisk manipulerede dyr. Modellen har en vis belastning og leverandørspecifik variation i OIR induktion, som bør tages i betragtning ved udformningen af eksperimenterne.
Introduction
Pålidelige og reproducerbare eksperimentelle modeller er nødvendige for at studere patologien bag angiogene øjensygdomme og for at udvikle nye terapeutiske til disse ødelæggende sygdomme. Patologisk angiogenese er kendetegnende for våd aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og for mange iskæmiske nethindesygdomme blandt dem retinopati af prematurity (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinale vene okklusion (RVO)1,2,3,4. Humane og gnaver nethinder følge et lignende udviklingsmønster, som både menneskelige og gnaver nethinden er blandt de sidste væv, der er vaskulære. Før nethindens vaskulatur er helt udviklet, modtager nethinden sin næringsstofforsyning fra hyaloid vaskulatur, som igen regresserer, når nethindens vaskulatur begynder at udvikle1,2. Hos mennesker er nethindevakulær udvikling afsluttet før fødslen, mens væksten af nethindevakulature hos gnavere sker efter fødslen. Da nethinden vaskulær udvikling sker postnatally hos gnavere, giver det et ideelt modelsystem til at studere angiogenese2,3. De nyfødte gnavere har en avascular nethinde, der udvikler sig gradvist, indtil fuldstændig vaskulær nethinden udvikling er opnået ved udgangen af tredje postnatal uge4. De voksende blodkar af neonatal mus er plast, og de gennemgår regression under hyperoxia stimulus5.
ROP er den hyppigste årsag til barndommen blindhed i vestlige lande, da det påvirker næsten 70% af de for tidligt fødte spædbørn med fødselsvægt under 1.250 g6,7. ROP forekommer hos for tidligt fødte spædbørn, der er født før nethindefartøjer fuldføre deres normale vækst. ROP skrider frem i to faser: I fase I forsinker præmature fødsel nethindens vaskulære vækst, hvor den ufærdige vaskularisering af den udviklende nethinde efter fase II forårsager hypoxi, hvilket fremkalder udtryk for angiogene vækstfaktorer, der stimulerer ny og unormal vækst iblodkarrene 8. OIR-modellen har været en udbredt model til at studere patofysiologien af ROP og andre iskæmiske retinopatier samt til at teste nye lægemiddelkandidater2,3,9. Det betragtes bredt som en reproducerbar model til gennemførelse af proof-of-concept-undersøgelser for potentielle antiangiogene lægemidler til okulære såvel som ikke-okulære sygdomme. De to gnaver modeller, dvs mus og rotte OIR adskiller sig i deres model induktion og sygdom fænotype. Rottemodellen efterligner ROP-fænotype mere præcist, men musemodellen giver en mere robust, hurtig og reproducerbar model til nethindeneovascularisering (NV). I musemodellen udvikler NV sig til den centrale nethinde. Denne patologiske udlæsning er vigtig i farmakologiske effektundersøgelser for mange iskæmiske retinopatier, såsom PDR, RV og eksudativ AMD samt for ikke-okulære, angiogene sygdomme som kræft. Desuden gør tilgængeligheden af genetisk manipulerede (transgene og knockout) mus musen OIR-modellen til en mere populær mulighed. Men hverken mus eller rotte OIR model skaber nethindefibrose, som er typisk i sygdomme hos mennesker.
Forståelsen af, at høje iltniveauer bidrager til udviklingen af ROP i 1950’erne10,11 førte til udviklingen af dyremodeller. De første undersøgelser om virkningen af ilt på nethindevakulaturen blev udført i 195012,13,14 og indtil 1990’erne var der mange forbedringer af OIR-modellen. Forskningen af Smith et al. i 1994 satte en standard for den nuværende mus OIR model, der adskiller hyaloidopati fra retinopati15. En bred vedtagelse af metoden til at kvantificere vaso-udslettelse og patologisk NV af Connor et al. (2009) yderligere øget sin popularitet16. I denne model placeres mus ved 75% ilt (O2)i 5 dage ved P7, efterfulgt af 5 dage under normoxiske forhold. Hyperoxi fra P7 til P12 forårsager nethindevakulature at regressere i det centrale nethinden. Når man vender tilbage til normoxiske tilstande, bliver avascular nethinden hypoksisk (Figur 1A). På grund af de hypoksiske stimuli i den avaskulære centrale nethinde spirer nogle af nethindens blodkar mod det glasagtige og danner præretinal NV, kaldet præretinal tufts2,3. Disse tufts er umodne, og hyperpermeable. Mængden af NV topper ved P17, hvorefter den går tilbage. Nethinden er fuldt revascularized og NV er fuldt regresseret af P23 – P25 (Figur 2A)2,3.
OIR-modellen for rotter (ved hjælp af forskellige niveauer af O2) blev første gang beskrevet i 1990’erne og viste, at varierende O2-niveauer ved 80% og 40% forårsager mere udtalt NV end under 80% O2 konstant eksponering17. Senere blev det opdaget, at den intermitterende hypoxi model, hvor O2 er cyklet fra hyperoxi (50%) hypoxi (10-12 %), forårsager endnu mere NV end 80/40% O2 model18. I 50/10%-modellen udsættes rotteunger for 50% i 24 timer, efterfulgt af 24 timer i 10% O2. Disse cyklusser fortsættes indtil P14, hvor rotterungerne returneres til normoxiske tilstande (figur 1B). Som hos humane ROP-patienter udvikler avascularområderne i rottemodellen sig til nethindens periferi på grund af umodne nethindevakulære plexus (Figur 3).
I begge modeller er de vigtigste parametre, der normalt kvantificeres, størrelsen af AVA og NV. Disse parametre analyseres typisk fra nethindebeslag, hvor endotelcellerne er mærket4,16. Tidligere blev mængden af præretinal NV evalueret fra nethinde tværsnit ved at tælle blodkar eller vaskulære cellekerner, der strækker sig til glasagtige over den indre begrænsende membran. Den største begrænsning af denne fremgangsmåde er, at det ikke er muligt at kvantificere ava’erne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sværhedsgraden af sygdom fænotype er afhængig af både stammen og endda sælger i både mus og rotte OIR modeller23. Dette tyder på, at der er en bred genotypisk variation i patologisk udvikling. Generelt udvikler pigmenterede gnavere mere alvorlig fænotype end albinoerne. F.eks. revasculariseres nethindevaculaturen af albino BALB/c hurtigt efter hyperoxi og udvikler slet ikke NV24. Tilsvarende viser pigmenterede Brune Norge rotter hos rotter mere alvorlig patologi end…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen og Anne Kankkunen for fremragende teknisk support. Dette arbejde blev finansieret af Finlands Akademi, Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation, Tampere Tuberculosis Foundation, Finnish Medical Foundation, Pirkanmaa Hospital District Research Foundation og Tampere University Hospital Research Fund.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
References
- Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
- Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
- Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
- Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
- Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
- Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
- Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
- Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
- Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
- Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
- Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
- Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
- Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
- Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
- Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
- Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
- Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
- Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
- Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
- Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
- Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
- Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
- Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
- Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
- Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
- Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
- Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
- Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
- Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
- Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).
