Protokollen, der præsenteres her, giver information om samtidig elektroencefalografi (EEG) og adfærdsmæssig vurdering i realtid. Vi har diskuteret alle trin, der er involveret i denne protokol, som en attraktiv løsning for forskere inden for mange områder af neurovidenskab, især inden for lærings- og hukommelsesområder.
Brainwaves amplitude opnået fra elektroencefalografi (EEG) har været velkendt som grundlag for kognitiv kapacitet, hukommelse og læring på dyr og mennesker. Voksen neurogenese mekanisme er også forbundet med hukommelse og læring forbedring. Traditionelt plejede forskere at vurdere lærings- og hukommelsesparametre i gnavermodeller ved adfærdsmæssige opgaver. Derfor er samtidig overvågning af adfærdsændringer og EEG særlig interessant i korrelering af data mellem hjerneaktivitet og opgaverelateret adfærd. Imidlertid er det meste af det udstyr, der kræves for at udføre begge undersøgelser, enten komplekst, dyrt eller bruger et kablet opsætningsnetværk, der forhindrer de naturlige dyrs bevægelse. I denne undersøgelse blev EEG registreret med en trådløs elektrofysiologisk enhed sammen med udførelsen af en ny objektgenkendelsesopgave (NORT). Dyrets adfærd blev overvåget samtidigt af et videosporingssystem. Begge optagelser blev analyseret offline af deres tidsstempler, som blev synkroniseret for at forbinde EEG-signaler med dyrets handlinger. Forsøgspersonerne består af voksne Wistar-rotter efter mellemfristet miljøberigelsesbehandling. Seks kranieskrueelektroder blev fastgjort parvis på begge halvkugler over frontale, centrale og parietale regioner og blev henvist til en elektrode placeret bageste af næsebenet. NORT protokollen består i at udsætte dyret for to identiske genstande i 10 min. Efter 2 timer og 24 timer blev et af objekterne erstattet med en roman. Udforskningstiden for hvert objekt blev overvåget af en adfærdssporingssoftware (BTS) og EEG-dataregistrering. Analysen af EEG synkroniseret med adfærdsdata består af estimater af alfa- og beta-relativ båndeffekt og sammenligninger mellem ny objektgenkendelse versus velkendt objektudforskning mellem tre eksperimentelle faser. I dette manuskript har vi diskuteret elektrodefremstillingsproces, epiduralelektrodeimplantationskirurgi, miljøberigelsesprotokol, NORT-protokol, BTS-opsætning, EEG – BTS-kobling til samtidig overvågning i realtid og EEG-dataanalyse baseret på automatisk hændelsesdetektion.
Adfærdstest er afgørende i neurovidenskabelig forskning for en stor mængde information genereret i en in vivo-sammenhæng. I denne henseende har forskere i vid udstrækning brugt forskellige adfærdstest til at analysere sensorisk motorisk funktion, sociale interaktioner, angstlignende og depressiv-lignende adfærd, stofafhængighed og forskellige former for kognitive funktioner1. Manuel registrering af adfærdstest kan være vanskelig, udmattende og unøjagtig, selv for de fleste ekspertobservatører. Selvom der er gjort en vis indsats for at udvikle gratis og open source-software til adfærdsregistrering (f.eks. sexrat male2-app til seksuel adfærd), tillader flere alternativer automatisk og realtids adfærdsregistrering af forskellige dyrearter fra fisk3 til gnavere 4,5,6. Videosporing er en værdifuld metode til hurtig og præcis adfærdsregistrering, der anvendes i en lang række applikationer7. En mere potentiel funktion i adfærdsregistreringsområdet er at udforske neural aktivitet under adfærdsmæssig manifestation. Samtidig registrering af neuronal aktivitet (fra enkeltceller til de store hjerneområder) og adfærdsmæssige opgaver kunne vise os, hvordan hjernen genererer specifikke adfærdsmønstre8. Adfærd er en sekvens af mindre komponenter, der kan afsløre korrelater mellem den neurale aktivitet og bevægelser eller handlinger. Hvis neuronal aktivitet og adfærdsmønstre kunne registreres samtidigt gennem flere tidsskalaer, kunne de forklare, hvordan hver hjernetilstand korrelerer med hver enkelt adfærd (for en mere dybdegående undersøgelse af adfærdsmæssig optagelse, se Datta et al., 2019 anmeldelse8). Derfor betragtes synkroniseret optagelse af adfærdsmæssig og neuronal aktivitet i den ønskede skala (fra neuroner til store områder af hjernen) som et yderst nyttigt værktøj. Der er flere systemer beregnet til at integrere adfærdsmæssige optagelser med andre målinger som neural aktivitet 4,5.
Selvom elektroencefalografi betragtes som en af de mest anvendte teknikker inden for klinisk og forskningsneurovidenskab, gør den relativt høje mobilitet såvel som størrelsen på EEG-registreringsenheden denne teknik unik og udfordrende til detektion i tilfælde af in vivo-modeller9. Nogle løsninger på dette problem er blevet udviklet, f.eks. brugen af kabler og drejeanordninger, der gør det muligt for dyr at bevæge sig frit i arenaen. Ikke desto mindre medfører kabelbaserede systemer ofte problemer med at gennemføre undersøgelser, f.eks. under overførsel af et dyr fra et bur til et andet observeres hindring eller sammenfiltring af dyret med kablerne. Telemetriske enheder er udviklet til trådløse elektrofysiologiske optagelser for at øge fleksibiliteten i optagelsessituationen10,11. Sådanne systemer har imidlertid vist betydelige begrænsninger på grund af deres lave antal optagekanaler og lave samplingfrekvenser11. I denne undersøgelse brugte vi et kommercielt tilgængeligt trådløst system, der sender EEG-signaler fra dyret gennem en Wi-Fi-forbindelse med et frit bevægeligt gnaversystem12. Apparatet vejer 6 gram og kan modstå op til 16 kanaler optaget ved 1 kSps. Dette system tillader EEG- eller spike-registrering i dyremiljøet med en reduceret forstyrrelse, der fungerer som en økonomisk løsning sammenlignet med de traditionelle elektrofysiologiske systemer på markedet. Derudover har vi synkroniseret disse data ved hjælp af en videosporingssoftware for at give sammenhæng mellem EEG og adfærdsmønstre. Denne synkronisering udføres offline ved justering og interpolation af data og hændelser baseret på tidsstempler genereret af begge systemer og behandles på MATLAB.
Voksen neurogenese defineres som spredning, overlevelse og differentiering i neuroner af nygenererede celler i dentate gyrus af dyr13,14. Denne proces er kendt for at være forbundet med hukommelses- og læringsforbedring, hvilket øger voksen neurogenese hos gnavere gennem berigede miljøforhold (EE)15. EE består i at huse gnavere i små grupper inde i et stort bur forsynet med legetøj og rør, hvor dyr har ny og kompleks, men ingen biologisk relevans15. Selvom EE stimulerer hippocampus neurogenese, varierer det også i mange faktorer såsom alder, dyrestamme, specifikke stimuleringsbetingelser eller neurogenesedetektionsprocedure. Hos midaldrende mus udsat for EE-boliger i syv dage er fødslen af nye granulære celler (GC) i hippocampus dentate gyrus (DG) blevet rapporteret16. Undersøgelser, der forsøger selektivt at ablate voksen neurogenese hos voksne rotter, har antydet, at nye granulære celler på ca. 1 – 2 uger er nødvendige i det lærte respons17. Omkring 2 eller 3 uger efter, at GC er født hos voksne DG, begynder flere karakteristiske træk såsom dendritiske rygsøjler, som er afgørende for excitatorisk synaptisk transmission18, at dukke op. Zhao et al. udførte en kvantitativ analyse for at vise, at toppen af rygsøjlevæksten forekommer i løbet af de første 3 – 4 uger19. Flere elektrofysiologiske in vivo-undersøgelser tyder på, at kun tre ugers EE-boligforhold giver ændringer i GD’s synaptiske transmission og øger celleexcitabiliteten20. Det er også blevet rapporteret, at eksponering for et beriget miljø 1-4 uger efter BrdU-injektioner signifikant øgede densiteten af BrdU/NeuN-celler i DG-granulatlaget hos mus21. Disse forfattere foreslår, at der eksisterer en kritisk periode mellem en og tre uger efter EE-eksponering, da der blev observeret en betydelig stigning i antallet af nye neuroner21. Undersøgelser af hippocampus neurogenese hos voksne (AHN) hos mennesker har været kontroversielle, da der ikke var nogen direkte beviser. En nylig rapport beskrev imidlertid udviklingsstadierne af AHN i den menneskelige voksne hjerne og identificerede tusindvis af umodne neuroner i DG og demonstrerede derved vigtigheden af AHN under aldring hos mennesker22. Baseret på de tidligere nævnte beviser er undersøgelsen af AHN i dyremodeller vigtigere end nogensinde (for en mere dybdegående undersøgelse af AHN, se Leal-Galicia et al., 2019 review15).
Som tidligere nævnt har hippocampus været forbundet med en grundlæggende funktion i lærings- og hukommelseskapacitet. Dannelsen af minder gennemgår tre forskellige processer: kodning (hukommelsesopsamling), konsolidering (hukommelseslagring) og hentning (hukommelsesgenkendelse)23. Genkendelseshukommelse hos mennesker testes ved hjælp af den visuelle parrede sammenligningsopgave24. Grundlaget for menneskelige og dyremodeller for hukommelse og hukommelsestab er adfærdstestene, der vurderer evnen til at genkende en tidligere præsenteret stimuli25,26, som den visuelle parrede sammenligningsopgave gør hos mennesker. Derfor er en af de mest anvendte adfærdsmæssige tests til vurdering af en gnavers evne til at genkende en tidligere præsenteret stimulus, det vil sige lærings- og hukommelseskapaciteten den spontane nye objektgenkendelsesopgave (NORT)23,27. NORT-protokollen består af to identiske nye objekter i en velkendt arena i 10 minutter i erhvervelsesforsøget. Efter en bestemt tid mellem 0 28 og48 timer29 (variabel tid i henhold til hver protokol) returneres dyret til den samme arena, der indeholder en af de samme velkendte genstande og en ny genstand. Dyret udforsker spontant det nye objekt, hvis det velkendte objekt blev husket26. Præferenceforholdet bruges almindeligvis til vurdering af efterforskningsresultater. Det bestemmes ved at dividere den samlede objektudforskningstid fra udforskningstiden for romanen eller det velkendte objekt. NORT har nogle fordele i forhold til andre genkendelseshukommelsestest. Vigtigst af alt kræver det ingen ekstern motivation, belønning eller straf. Det skaber ikke stressende forhold. Endelig er der ikke behov for træning for at fremkalde adfærden ved at udforske objekterne (for en mere dybtgående undersøgelse af NORT, se ref.23).
Derfor er samtidig registrering af flere datamodaliteter og deres integration i studiet af læring og hukommelse som en effekt af voksen hippocampal neurogenese meget attraktiv og giver en overbevisende løsning for forskere på området. Dette arbejde vil afsløre alle processer, der er involveret i samtidig adfærdsmæssig videosporingsvurdering (ny objektgenkendelsesopgave) og trådløs elektroencefalografioptagelse. Her har vi gennemgået elektrodefremstillingsprocessen, epidural (kranieskrue) elektrodeimplantationskirurgi, miljøberigelsesprotokol (til hippocampus neurogeneseinduktion), efter NORT-protokol, BTS-opsætning, EEG – BTS-kobling til samtidig overvågning i realtid og EEG- og adfærdsdataanalyse udført på MATLAB-computermiljø.
Adfærds- og elektroencefalografiforskning er vanskelig og udfordrende af natur. Derfor præsenterer kombinationen af begge teknikker betydelige kritiske trin. Således anvendes begge samtidige teknikker ikke i vid udstrækning. I praksis udfører hver gruppe rundt om i verden adfærdsmæssige tests med særlige forhold, såsom dyr, analyserede parametre eller behandlinger. Ovenstående skaber betydelige kontroverser på området og behovet for at udvikle standardprocedurer, der er tilgængelige for alle. Her har vi forberedt denne detaljerede procedure med alle de kritiske trin og metodologiske overvejelser, der normalt ikke beskrives eller nævnes i de fleste af de offentliggjorte artikler. Disse diskuteres nedenfor.
Produktion af de nødvendige materialer er et grundlæggende skridt i succesen med denne teknik. I denne henseende skal elektroden bygges fra bunden ved hjælp af skruer i rustfrit stål, kobberkabler og sølvsvejser. Disse materialer er vanskelige at svejse sammen permanent på en sådan måde, at ledningsevnen og styrken af hver elektrode skal verificeres før brug. Det er muligt at bruge en anden type ledning til elektrodeenheden; Kobberet er dog fleksibelt nok til at manipulere elektroden for at indsætte den i forstærkerstikket. I denne henseende er brugen af kommercielle elektroder ønskelig, men deres erhvervelse kan være kompliceret og dyr. Operationen er et af de mest kritiske trin i denne protokol. Det anbefales stærkt og endda nødvendigt at have en erfaren kirurg, især til implantation af elektroder. Da operationen ofte kræver forlængelse af anæstesitiden og undertiden en svejseapplikation under operationen, skal hvert laboratorium udføre de nødvendige tests med passende anæstesi (forskellige cocktails kan bruges) for hver stamme af gnavere, især under vivariumforhold, forskelle mellem kuld og endda individuelle forskelle mellem dyr. Korrekt planlægning og overvejelse kan forhindre tab af dyr under operationer. Elektrodeimplantationen er et andet afgørende skridt. Det kræver stor omhu at undgå at slå kraniet og beskadige meninges eller hjernevæv. Skruer skal placeres korrekt, det vil sige helt fastgjort i kraniet, ellers vil støj og artefakter blive præsenteret på signaler, som dem, der er relateret til en elendig colocation eller bevægelse, der ikke bruger EEG-optagelsen. Præ- og postoperativ behandling og tilstande skal altid udføres og observeres for at undgå gnaverens lidelse. Subkutan lidokain kan bruges på hovedhuden, inden snittet foretages med skalpellen. En dråbe saltvand til dyrets øjne hjælper med at forhindre tørhed. Der skal også indgives en saltopløsning i munden, og efter operationen skal 1 ml administreres enten subkutant eller intraperitonealt for at kompensere dyrets væskebalance og forhindre dehydrering. Umiddelbart efter operationen skal en antiinflammatorisk medicin (for at reducere smerte) samt antibiotika via subkutane eller topiske antibiotika administreres direkte i periferien af hovedbunden, hvor tandcementhætten er placeret (for at mindske sandsynligheden for infektion). Gentag ovenstående procedure 24 timer efter operationen. Placeringen af EEG-forstærkeren på dyrets ryg er den største vanskelighed for samtidig optagelse. Design og fremstilling af en vest er specifikt baseret på dyrenes størrelse. Vesten skal tillade gnaverens naturlige bevægelse (se figur 5). Sidstnævnte vil garantere den største fordel ved teknikken, som er registrering af frie bevægelser. Da dyrene ikke forsøgte at fjerne vesten, hovedstikket eller kablerne efter operationen og i de efterfølgende dage, blev det antaget, at opsætningen ikke genererede bevægelsesbegrænsning væsentligt eller forårsagede smerte eller ubehag. For en korrekt EEG-segmentering i epoker baseret på begivenheder markeret af BTS er obligatorisk at nedskrive en veldefineret protokol. De midlertidige mærker kunne flettes ved tidsseriemanipulation, fordi begge systemer bruger det samme ur til at indstille deres tidsstempler. Ovenstående udvider mulighederne for dyreforsøg med elektrofysiologiske data til analyse.
Teknikken, der præsenteres her, kan bruges i ethvert neurovidenskabeligt forskningsområde og med de mest almindelige murinarter og endda andre arter. Alsidigheden af adfærdssporingssoftwaren er en af de mest betydningsfulde fordele, da den kunne bruges i en stor alsidighed af labyrinter som Morris vandlabyrint, åbent felt, ny objektgenkendelse, konditioneret stedpræference, hulbræt, forhøjet plus labyrint, Y-labyrint, radial armlabyrint, Barnes-labyrint og andre. Det kan bruges op til 16 kameraer samtidigt. Derudover kan hundredvis af forskellige foranstaltninger (for mere detaljerede oplysninger se manualerne31,32) rapporteres. Overvej at dette arbejde beskriver eksperimentering for EEG-optagelser, nogle andre teknikker som Local Fields Potentials eller single-unit optagelse er mulige. Brugere skal dog overveje, at den generelle opsætning og flere forberedende trin skal ændres til andre formål. Så når denne teknik bruges sammen med EEG Wi-Fi-optagelse, udvides mulighederne, fordi det tilføjer nye perspektiver til dyreforsøg som dem, der udføres på mennesker for at evaluere flere egenskaber ved EEG-integrationen og dynamikken, som tilslutningsmuligheder, EEG-båndeffekt eller fremkaldte reaktioner. I modsætning til mennesker er dyreforsøg mulige at evaluere lægemiddeladministration, genmodifikationer eller ekspression blandt mange andre eksperimentelle paradigmer. For EEG-analyse skal du overveje, at nogle protokoller har et meget lavt antal gentagelser af den ønskede adfærd, hvilket begrænser muligheden for gennemsnitlige svar og opnå pålidelige resultater. Vær derfor omhyggelig med at designe de optagelses- og analyseprotokoller, som det anses for at udføre, før eksperimentet påbegyndes. Ikke desto mindre skal det overvejes, at arbejde i dyreforsøg ikke er muligt at forhindre bevægelse, hvilket øger kompleksiteten af den eksperimentelle protokol og overvejelser om signalanalyse og adfærdsmæssige opgaver. I øjeblikket er udstyr til fulde sporingssystemer og EEG-optagelser ikke standardiseret eller modulært, hvilket betyder, at deres opsætning er beregnet til en enkelt protokol og tilpasninger til at udforske andre adfærdsmæssige opgaver, hvilket indebærer / foreslår højere omkostninger for et stort antal laboratorier. Denne situation kan løses ved at følge de muligheder, der er forklaret i denne undersøgelse. Ikke desto mindre kunne flere forbedringer realiseres for mere pålidelige eksperimenter. Arbejdet kan forbedres i flere trin startende fra elektrodefremstilling gennem adfærds- og signalbehandling. Ikke desto mindre demonstreres det, at dyresporing og EEG-erhvervelse er mulig ved hjælp af en overkommelig højteknologisk, men billig opsætning.
Sammenfattende er dette arbejde et forsøg på at hjælpe forskere, især inden for neurovidenskab, til at kunne bruge disse to teknikker, der ikke almindeligvis anvendes i kombination. Den samtidige optagelsesteknik for EEG og adfærdstest ved hjælp af adfærdssporingssoftware har mange fordele, og det kan være særligt nyttigt inden for mange områder af neurovidenskab, især inden for lærings- og hukommelsesområder. I betragtning af at dette udstyr har andre muligheder som en dyb registrering af subkortiske strukturer som hippocampus, men som nævnt vil flere forberedende trin ændre sig. Trådløst udstyr løser næsten alle begrænsningerne ved en konventionel trådtilgang, såsom dyrs mobilitetsproblemer fra et bur til et andet, hindrede eller sammenfiltrede dyr med kablerne. Denne opsætningsteknik er brugervenlig, som beskrevet ovenfor, og en næsten utrænet eller ikke-specialiseret gruppe af eksperter eller enkeltpersoner kan bruge denne software. Prisen for EEG-udstyret er lavere end en almindelig EEG-forstærker. Behavioral Tracking Software er også en af de mest overkommelige software til videosporing på markedet. Denne software kræver årlige licenser. Udstyret kan bruges i mere end en eksperimentel opsætning, forskellige dyr og typen af alsidighed. Vi håber, at denne indsats vil hjælpe det videnskabelige samfund og give en nem adgang til samtidig at studere adfærd og elektroencefalografi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Miguel Burgos og Gustavo Lago for at yde teknisk bistand. Vi er taknemmelige for Stoelting Co. for at dække videoproduktionsomkostningerne, Jinga-hi, Inc. for at yde teknisk bistand og División de Investigación y Posgrado fra Universidad Iberoamericana Ciudad de México for at yde midler til dette arbejde.
#2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
#4 Scalpel and blade | |||
50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
Camera | Logitech | c920 | |
Copper wire | |||
Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
DELL PC | DELL | ||
Electrode | |||
JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
Screws | |||
Screws equiped with electrode | |||
Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |