Protokollet som presenteras här ger information om samtidig elektroencefalografi (EEG) och beteendebedömning i realtid. Vi har diskuterat alla steg som är involverade i detta protokoll som en attraktiv lösning för forskare inom många områden av neurovetenskap, särskilt inom inlärnings- och minnesområden.
Hjärnvågornas amplitud erhållen från elektroencefalografi (EEG) har erkänts som en grund för kognitiv kapacitet, minne och lärande på djur och människor. Vuxen neurogenes mekanism är också kopplad till minne och lärande förbättring. Traditionellt brukade forskare bedöma inlärnings- och minnesparametrar i gnagarmodeller genom beteendeuppgifter. Därför är samtidig övervakning av beteendeförändringar och EEG särskilt intressant för att korrelera data mellan hjärnaktivitet och uppgiftsrelaterade beteenden. Men det mesta av utrustningen som krävs för att utföra båda studierna är antingen komplex, dyr eller använder ett trådbundet installationsnätverk som hindrar de naturliga djurens rörelse. I denna studie registrerades EEG med en trådlös elektrofysiologisk enhet tillsammans med utförandet av en ny objektigenkänningsuppgift (NORT). Djurets beteende övervakades samtidigt av ett videospårningssystem. Båda inspelningarna analyserades offline av sina tidsstämplar som synkroniserades för att länka EEG-signaler med djurets handlingar. Försökspersonerna består av vuxna Wistar-råttor efter behandling med miljöberikning på medellång sikt. Sex skalleskruvelektroder fixerades parvis på båda halvkärmen över frontala, centrala och parietala regioner och refererades till en elektrod belägen bakom näsbenet. NART-protokollet består av att utsätta djuret för två identiska föremål i 10 minuter. Efter 2 h och 24 h ersattes ett av föremålen med ett nytt. Utforskningstiden för varje objekt övervakades av en beteendespårningsprogramvara (BTS) och EEG-dataregistrering. Analysen av EEG synkroniserad med beteendedata består av uppskattningar av alfa- och beta-relativ bandkraft och jämförelser mellan ny objektigenkänning kontra bekant objektutforskning, mellan tre experimentella steg. I detta manuskript har vi diskuterat elektrodtillverkningsprocess, epiduralelektrodimplantationskirurgi, miljöanrikningsprotokoll, NORT-protokoll, BTS-installation, EEG – BTS-koppling för samtidig övervakning i realtid och EEG-dataanalys baserad på automatisk händelsedetektering.
Beteendetest är avgörande inom neurovetenskaplig forskning för en stor mängd information som genereras i ett in vivo-sammanhang. I detta avseende har forskare i stor utsträckning använt olika beteendetester för att analysera sensorisk-motorisk funktion, sociala interaktioner, ångestliknande och depressivt beteende, substansberoende och olika former av kognitiva funktioner1. Manuell registrering av beteendetester kan vara svårt, ansträngande och felaktigt även för de flesta expertobservatörer. Även om vissa ansträngningar har gjorts för att utveckla gratis programvara med öppen källkod för beteenderegistrering (t.ex. sexrat man2-app för sexuellt beteende), möjliggör flera alternativ automatisk och realtidsbeteenderegistrering av olika djurarter från fisk3 till gnagare 4,5,6. Videospårning är en värdefull metod för snabb och exakt beteendeinspelning som används i en mängd olika applikationer7. En mer potentiell funktion i beteendeinspelningsområdet är att utforska neural aktivitet under beteendemässig manifestation. Samtidig registrering av neuronaktivitet (från enskilda celler till de stora hjärnområdena) och beteendeuppgifter kan visa oss hur hjärnan genererar specifika beteendemönster8. Beteenden är en sekvens av mindre komponenter som kan avslöja korrelat mellan neural aktivitet och rörelser eller handlingar. Om neuronal aktivitet och beteendemönster samtidigt kunde registreras genom flera tidsskalor skulle de kunna förklara hur varje hjärntillstånd korrelerar med varje enskilt beteende (för en mer djupgående undersökning av beteenderegistrering, se Datta et al., 2019 granskning8). Därför anses synkroniserad inspelning av beteendemässig och neuronal aktivitet i önskad skala (från neuroner till stora delar av hjärnan) betraktas som ett extremt användbart verktyg. Det finns flera system avsedda att integrera beteenderegistreringar med andra mätningar som neural aktivitet 4,5.
Även om elektroencefalografi anses vara en av de mest använda teknikerna inom klinisk och forskningsneurovetenskap, gör den relativt höga rörligheten, liksom storleken på EEG-inspelningsanordningen, denna teknik unik och utmanande för detektion vid in vivo-modeller9. Vissa lösningar på detta problem har utvecklats, t.ex. användning av kablar och svängbara anordningar som gör att djur kan röra sig fritt i arenan. Kabelbaserade system medför dock ofta problem för att genomföra studier, t.ex. under överföringen av ett djur från en bur till en annan observeras hinder eller intrassling av djuret med kablarna. Telemetriska enheter har utvecklats för trådlösa elektrofysiologiska inspelningar för att öka flexibiliteten i inspelningssituationen10,11. Sådana system har dock visat betydande begränsningar på grund av deras låga antal inspelningskanaler och låga samplingsfrekvenser11. I denna studie använde vi ett kommersiellt tillgängligt trådlöst system som skickar EEG-signaler från djuret via en Wi-Fi-anslutning med ett fritt rörligt gnagaresystem12. Apparaten väger 6 gram och tål upp till 16 kanaler inspelade vid 1 kSps. Detta system möjliggör EEG- eller spikregistrering i djurmiljön, med minskad störning, vilket fungerar som en ekonomisk lösning jämfört med de traditionella elektrofysiologiska systemen på marknaden. Dessutom har vi synkroniserat dessa data med hjälp av en videospårningsprogramvara för att ge korrelation mellan EEG och beteendemönster. Denna synkronisering görs offline genom justering och interpolering av data och händelser baserat på tidsstämplar som genereras av båda systemen och bearbetas på MATLAB.
Vuxen neurogenes definieras som proliferation, överlevnad och differentiering i neuroner av nygenererade celler i dentate gyrus hos djur13,14. Denna process är känd för att vara associerad med minnes- och inlärningsförbättring som ökar vuxen neurogenes hos gnagare genom anrikad miljö (EE) tillstånd15. EE består av att hysa gnagare i små grupper i en stor bur försedd med leksaker och rör, där djur har nya och komplexa men ingen biologisk relevans15. Även om EE stimulerar hippocampus neurogenes, varierar det också i många faktorer som ålder, djurstam, specifika stimuleringsförhållanden eller neurogenesdetekteringsprocedur. Hos medelålders möss som exponerats för EE-inhysning i sju dagar har födelsen av nya granulära celler (GC) i hippocampus dentate gyrus (DG) rapporterats16. Studier som försöker ablatera vuxen neurogenes hos vuxna råttor selektivt har föreslagit att nya granulära celler med cirka 1 – 2 veckors ålder krävs i det inlärda svaret17. Cirka 2 eller 3 veckor efter att GC är födda hos vuxna DG, börjar flera karakteristiska egenskaper som dendritiska ryggar, som är väsentliga för excitatorisk synaptisk överföring18, dyka upp. Zhao et al. utförde en kvantitativ analys för att visa att toppen av ryggradstillväxt inträffar under de första 3 – 4 veckorna19. Flera elektrofysiologiska in vivo-studier tyder på att endast tre veckors EE-inhysningsförhållanden ger förändringar i DG: s synaptiska överföring och ökar cellens excitabilitet20. Det har också rapporterats att exponering för en anrikad miljö 1–4 veckor efter BrdU-injektioner signifikant ökade densiteten av BrdU / NeuN-celler i DG-granulärt skikt hos möss21. Dessa författare föreslår att en kritisk period existerar mellan en och tre veckor efter EE-exponering eftersom en väsentlig ökning av antalet nya neuroner observerades21. Studier av vuxen hippocampus neurogenes (AHN) hos människor har varit kontroversiella eftersom det inte fanns några direkta bevis. En ny rapport beskrev emellertid utvecklingsstadierna av AHN i den mänskliga vuxna hjärnan, identifierade tusentals omogna neuroner i GD och visade därmed vikten av AHN under åldrande hos människor22. Baserat på de bevis som nämnts tidigare är studien av AHN i djurmodeller viktigare än någonsin (för en mer djupgående undersökning av AHN, se Leal-Galicia et al., 2019 review15).
Som tidigare nämnts har hippocampus kopplats till en grundläggande funktion i inlärnings- och minneskapacitet. Bildandet av minnen går igenom tre distinkta processer: kodning (minnesförvärv), konsolidering (minneslagring) och hämtning (minnesigenkänning)23. Igenkänningsminnet hos människor testas med hjälp av Visual Paired Comparisons Task24. Grunden för mänskliga och djurmodeller av minne och amnesi är beteendetesterna som bedömer förmågan att känna igen en tidigare presenterad stimuli25,26, som den visuella parade jämförelseuppgiften gör hos människor. Därför är ett av de mest använda beteendetesterna för att bedöma en gnagares förmåga att känna igen en tidigare presenterad stimulans, det vill säga inlärnings- och minneskapaciteten den spontana nya objektigenkänningsuppgiften (NORT)23,27. NART-protokollet består av två identiska nya objekt i en bekant arena under 10 minuter i förvärvsförsöket. Efter en viss tid mellan 0 28 och48 timmar29 (varierande tid enligt varje protokoll) återförs djuret till samma arena som innehåller ett av samma välbekanta föremål och ett nytt föremål. Djuret utforskar spontant det nya objektet om det välbekanta objektet memorerades26. Preferensförhållandet används ofta vid bedömning av prospekteringsprestanda. Det bestäms genom att dividera den totala objektutforskningstiden från utforskningstiden för det nya eller bekanta objektet. NORT har vissa fördelar jämfört med andra igenkänningsminnestester. Viktigast av allt, det kräver ingen yttre motivation, belöning eller straff. Det genererar inte stressiga förhållanden. Slutligen behövs ingen träning för att framkalla beteendet att utforska föremålen (för en mer djupgående undersökning av NORT, se ref.23).
Därför är samtidig inspelning av flera datamodaliteter och deras integration i studien av inlärning och minne, som en effekt av vuxen hippocampus neurogenes mycket attraktiv och ger en övertygande lösning för forskare inom området. Det aktuella arbetet kommer att avslöja alla processer som är involverade i samtidig beteendemässig videospårningsbedömning (ny objektigenkänningsuppgift) och trådlös elektroencefalografiinspelning. Här har vi granskat elektrodtillverkningsprocessen, epidural (skalleskruv) elektrodimplantationskirurgi, miljöanrikningsprotokoll (för hippocampus neurogenesinduktion), efter NORT-protokoll, BTS-installation, EEG – BTS-koppling för samtidig övervakning i realtid och EEG och beteendedataanalys utförd på MATLAB-datormiljö.
Beteende- och elektroencefalografiforskning är svår och utmanande av naturen. Därför presenterar kombinationen av båda teknikerna betydande kritiska steg. Således används inte båda samtidiga teknikerna i stor utsträckning. I verklig praxis utför varje grupp runt om i världen beteendetester med speciella förhållanden, såsom djur, analyserade parametrar eller behandlingar. Ovanstående skapar betydande kontroverser på området och behovet av att utveckla standardförfaranden som är tillgängliga för alla. Här har vi förberett denna detaljerade procedur med alla kritiska steg och metodologiska överväganden som vanligtvis inte beskrivs eller nämns i de flesta publicerade artiklarna. Dessa diskuteras nedan.
Produktion av de nödvändiga materialen är ett grundläggande steg i framgången för denna teknik. I detta avseende måste elektroden byggas från grunden med skruvar av rostfritt stål, kopparkablar och silversvetsare. Dessa material är svåra att svetsa ihop permanent, på ett sådant sätt att konduktiviteten och styrkan hos varje elektrod måste verifieras före användning. Det är möjligt att använda en annan typ av tråd för elektrodaggregatet; Kopparn är dock tillräckligt flexibel för att manipulera elektroden för att sätta in den i förstärkarkontakten. I detta avseende är användningen av kommersiella elektroder önskvärd, men deras förvärv kan vara komplicerat och dyrt. Operationen är ett av de mest kritiska stegen i detta protokoll. Det rekommenderas starkt och till och med nödvändigt att ha en erfaren kirurg, särskilt för elektrodimplantation. Eftersom operationen ofta kräver förlängning av anestesitiden och ibland en svetsapplikation under operationen, måste varje laboratorium utföra de nödvändiga testerna med lämplig anestesi (olika cocktails kan användas) för varje stam av gnagare, särskilt under vivariumförhållanden, skillnader mellan kullar och till och med individuella skillnader mellan djur. Korrekt planering och övervägande kan förhindra att djur förloras under operationer. Elektrodimplantationen är ett annat viktigt steg. Det kräver stor försiktighet för att undvika att stansa skallen och skada hjärnhinnor eller hjärnvävnad. Skruvarna ska placeras korrekt, det vill säga helt fixerade i skallen, annars kommer brus och artefakter att presenteras på signaler, som de som är relaterade till en usel samlokalisering eller rörelse som inte använder EEG-inspelningen. Pre- och postoperativ behandling och tillstånd måste alltid utföras och observeras för att undvika gnagarens lidande. Subkutant lidokain kan användas på huvudhuden innan snittet görs med skalpellen. En droppe saltlösning till djurets ögon hjälper till att förhindra torrhet. Dessutom måste en saltlösning administreras i munnen, och efter operationen måste 1 ml administreras antingen subkutant eller intraperitonealt för att kompensera djurets vätskebalans och förhindra uttorkning. Omedelbart efter operationen måste ett antiinflammatoriskt läkemedel (för att minska smärta), liksom antibiotika via subkutana eller aktuella antibiotika, administreras direkt i periferin av hårbotten där tandcementlocket är beläget (för att minska sannolikheten för infektion). Upprepa ovanstående procedur 24 timmar efter operationen. Placeringen av EEG-förstärkaren på djurets rygg är den största svårigheten för samtidig inspelning. Designen och tillverkningen av en väst baseras specifikt på djurens storlek. Västen måste tillåta gnagarens naturliga rörelse (se figur 5). Den senare kommer att garantera den största fördelen med tekniken, vilket är inspelningen av fria rörelser. Eftersom djuren inte försökte ta bort västen, huvudkontakten eller kablarna efter operationen och under efterföljande dagar, antogs det att installationen inte genererade rörelsebegränsning signifikant eller orsakade smärta eller obehag. För en korrekt EEG-segmentering i epoker baserat på händelser markerade av BTS är det obligatoriskt att skriva ner ett väldefinierat protokoll. De tillfälliga markeringarna kan slås samman genom manipulering av tidsserier eftersom båda systemen använder samma klocka för att ställa in sina tidsstämplar. Ovanstående utökar möjligheterna för djurförsök som innehåller elektrofysiologiska data för analys.
Tekniken som presenteras här kan användas inom alla neurovetenskapliga forskningsområden och med de vanligaste murina arterna och till och med andra arter. Mångsidigheten hos beteendespårningsprogramvaran är en av de viktigaste fördelarna eftersom den kan användas i en stor mångsidighet av labyrinter som Morris vattenlabyrint, öppet fält, ny objektigenkänning, konditionerad platspreferens, hålbräda, förhöjd plus labyrint, Y-labyrint, radiell armlabyrint, Barnes labyrint och andra. Den kan användas upp till 16 kameror samtidigt. Dessutom kan hundratals olika åtgärder (för mer detaljerad information se manualerna31,32) rapporteras. Tänk på att detta arbete beskriver experiment för EEG-inspelningar, vissa andra tekniker som Local Fields Potentials eller inspelning av en enhet är möjliga. Användare måste dock tänka på att den allmänna installationen och flera förberedande steg måste ändras för andra ändamål. Så när denna teknik används tillsammans med EEG Wi-Fi-inspelning utökas möjligheterna, eftersom det lägger till nya perspektiv på djurstudier som de som utförs på människor för att utvärdera flera egenskaper hos EEG-integrationen och dynamiken, som anslutning, EEG-bandkraft eller framkallade svar. Till skillnad från människor är djurförsök möjliga för att utvärdera läkemedelsadministration, genmodifieringar eller uttryck, bland många andra experimentella paradigmer. För EEG-analys, anser att vissa protokoll har ett mycket lågt antal repetitioner av de önskade beteendena, vilket begränsar möjligheten att genomsnittliga svar och få tillförlitliga resultat. Var därför noga med att utforma de inspelnings- och analysprotokoll som det anses utföra innan experimentet påbörjas. Ändå måste det övervägas att arbete i djurförsök inte är möjligt att förhindra rörelse, vilket ökar komplexiteten i experimentprotokollet och överväganden för signalanalys och beteendeuppgifter. För närvarande är utrustning för fullständiga spårningssystem och EEG-inspelningar inte standardiserade eller modulära, vilket innebär att deras inställning är avsedd för ett enda protokoll och anpassningar för att utforska andra beteendeuppgifter, vilket innebär / föreslår högre kostnader för ett stort antal laboratorier. Denna situation kan lösas genom att följa de alternativ som förklaras i denna studie. Ändå kan flera förbättringar realiseras för mer tillförlitliga experiment. Arbetet kan förbättras i flera steg från elektrodtillverkning till beteende- och signalbehandling. Ändå är det visat att djurspårning och EEG-förvärv är möjliga med hjälp av en prisvärd högteknologisk men billig installation.
Sammanfattningsvis är detta arbete ett försök att hjälpa forskare, särskilt inom neurovetenskapsområdet, att kunna använda dessa två tekniker som inte vanligtvis används i kombination. Den samtidiga inspelningstekniken för EEG och beteendetestning med hjälp av beteendespårningsprogramvara har många fördelar, och det kan vara särskilt användbart inom många områden inom neurovetenskap, särskilt inom inlärnings- och minnesområden. Med tanke på att denna utrustning har andra funktioner som en djup inspelning av subkortikala strukturer som hippocampus, men som nämnts kommer flera förberedande steg att förändras. Trådlös utrustning löser nästan alla begränsningar i en konventionell trådstrategi, såsom djurs rörlighetsproblem från en bur till en annan, hindrade eller intrasslade djur med kablarna. Denna installationsteknik är användarvänlig, som beskrivits ovan, och en nästan otränad eller icke-specialiserad grupp experter eller individer kan använda denna programvara. Priset för EEG-utrustningen är lägre än en vanlig EEG-förstärkare. Behavioral Tracking Software är också en av de mest prisvärda programvarorna för videospårning på marknaden. Denna programvara kräver årliga licenser. Utrustningen kan användas i mer än en experimentell installation, olika djur och typen av mångsidighet. Vi hoppas att denna insats kommer att hjälpa det vetenskapliga samfundet och ge en enkel tillgång till samtidig studie av beteende och elektroencefalografi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Miguel Burgos och Gustavo Lago för teknisk hjälp. Vi är tacksamma mot Stoelting Co. för att täcka videoproduktionskostnaderna, Jinga-hi, Inc. för att tillhandahålla tekniskt bistånd och División de Investigación y Posgrado vid Universidad Iberoamericana Ciudad de México för att bevilja medel till detta arbete.
#2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
#4 Scalpel and blade | |||
50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
Camera | Logitech | c920 | |
Copper wire | |||
Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
DELL PC | DELL | ||
Electrode | |||
JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
Screws | |||
Screws equiped with electrode | |||
Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |