التنبؤ ببتر باستخدام خلايا السلف أحادية النوى في المرضى الذين يعالجون من الأوعية مع الإقفاريات الحرجة
Summary
قد يحدث بتر الأطراف السفلية حتى بعد رأب الأوعية من الأوعية المعرقلة في الإقفارية الطرف الحرج (CLI). تعكس خلايا السلف أحادية النوى (MPCs) إصلاح الأوعية الدموية. يصف هذا البروتوكول القياس الكمي لثناء الغدد العاملة من الدورة الدموية بالقرب من رأب الأوعية، وعلاقته بالخلل البطاحلي والتنبؤ ببتر الأطراف السفلية.
Abstract
يمثل إقفار الأطراف الحرجة (CLI) مرحلة متقدمة من مرض الشرايين المحيطية. عملية رأب الأوعية تحسن تدفق الدم إلى الطرف السفلي; ومع ذلك، تقدم بعض المرضى بشكل لا رجعة فيه إلى بتر الأطراف. إن مدى تلف الأوعية الدموية وآليات إصلاح الأوعية الدموية هي عوامل تؤثر على نتيجة ما بعد الرأب الوعائي. خلايا السلف أحادية النوى (MPCs) هي رد فعل على تلف الأوعية الدموية وإصلاحها ، مع القدرة على عكس أمراض الأوعية الدموية. يصف هذا البروتوكول القياس الكمي لـ MPCs التي تم الحصول عليها من الدورة الدموية من الأوعية القريبة من موقع رأب الأوعية، وكذلك علاقتها بالخلل البطايني وقدرتها التنبؤية على بتر الأطراف في الأيام الثلاثين التالية بعد رأب الأوعية في المرضى الذين يعانون من CLI.
Introduction
يتميز مرض الشرايين الطرفية (PAD) بانسداد الأوعية الدموية المزمن والتقدمي مع الحد من إمدادات الدم1. على نطاق عالمي، يؤثر PAD من الأطراف السفلية على حوالي 10٪ من السكان المسنين، في حين يتم تقديم ما يصل إلى 7٪ من هذه الحالات إلى بتر الأطراف2،3.
يمثل الإقفاريات الحرجة (CLI) العرض الأكثر خطورة لـ PAD1. المرضى عادة ما تعاني من الألم في الراحة, قرحة, أو الغرغرينا التي تعزى إلى الشرايين انسداد; في حين أن التشخيص السريري غير مواتية وتتميز بـ 30٪ من خطر بتر الأطراف والوفيات خلال 1 سنة3,4,5.
رأب الأوعية هو إجراء الأوعية الدموية طفيفة التوغل التي يمكن أن تعيد تدفق الدم إلى الطرف السفلي في المرضى الذين يعانون من CLI; ومع ذلك، فإن بعض المرضى تتطلب حتما بتر الأطراف الرئيسية، حتى بعد العلاج بتر الأوعية1،5. تحديد مبكر من النتائج غير المواتية بعد رأب الأوعية أمر قيم جدا، وذلك بسبب إمكانية إنفاذ العلاج.
قد توفر عوامل الخطر التقليدية قدرة تنبؤية محدودة لبتر الأطراف الرئيسية في المرضى الذين يخضعون لعملية CLI للرأب الوعائي6. تمثل المؤشرات الحيوية الموجهة للفيزياء المرضية طرقًا جديدة ذات تطبيقات سريرية محتملة ، والتي قد تؤدي إلى فائدة خاصة في الأمراض المتعلقة بإصابة الأوعية الدموية7. في الوقت الحاضر ، ومشاركة السكان الخلوية التي تملك خصائص إصلاح البطانية ، في موقع البلاك تصلب الشرايين ، وقد اعترف بشكل متزايد8،9.
وتستمد خلايا السلف أحادية النوى (MPCs) من نخاع العظام والخصائص الهيكلية والوظيفية الخاصة من الخلايا الجذعية مع قدرات تجديد الأوعية الدموية. نظرا لقدرة لجنة السياسة النقدية على التكاثر، والهجرة وإظهار الالتزام الأوعية الدموية; وقد أصبحت هذه الخلايا مرشحين جيدين لتعكس إصلاح endothelial ردا على10،11،12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاهتمام المستمر بالآليات الكامنة وراء إصابة الأوعية الدموية قد حفز على استكشاف الدور التنبؤي للعلامات الحيوية المحلية التي تحدث ، حيث أنها تعتبر تعكس تلف الأوعية الدموية وإصلاح7و13و14.
الغرض من هذه الدراسة هو وصف كيفية تحديد كمية ال MPCs التي تنتشر بالقرب من انسداد الأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من CLI يخضع لعملية رأب الأوعية; وكيفية تقييم العلاقة بين اللجان MPCs مع مؤشرات الخلل البطانية وبتر الأطراف.
بالمقارنة مع التكهن على أساس الأمراض المصاحبة وميزات الأوعية الدموية الجوهرية، فإن كمية ال MPCs المحلية تظهر قدرة محددة على التنبؤ بالنتائج السريرية فيما يتعلق بالخلل البطانية وبتر الأطراف. باستمرار، وقد وصفت بعض الدراسات دور التكهن من المؤشرات الحيوية مماثلة أثناء تقييم المرضى الذين يعانون من PAD15،16.
استناداً إلى النتائج السابقة7، قد تكون الطريقة الموصوفة هنا مفيدة لتحديد مبكر للسكان المعرضين لخطر النتائج الوعائية الضارة في العديد من البيئات السريرية ، مثل الأمعاء السفلية والأوعية الدموية والسكتة الدماغية والتهاب الأوعية الدموية والجلطات الوريدية وغيرها التي تنطوي على إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها.
Protocol
Representative Results
Discussion
قد تظهر عملية جمع الدم في الموقع الدقيق الكتلة الوعائية صعوبات تقنية؛ لذلك، قمنا بجمع الدم في القرب من كتلة الأوعية الدموية. وبالمثل، فإن كمية الـMPCs القريبة من اللويحات الوعائية تبدو ديناميكية للغاية وقد تنشأ اختلافات قبل وبعد رأب الأوعية. وفقا لملاحظاتنا، فمن المستحسن لتقييم خط الأساس ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون دعم البرنامج المؤسسي E015 للمشروع ID 356.2015.
Materials
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12×75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. . Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford’s vascular surgery (8th ed.). , (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O’Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
