Previsione dell'amputazione mediante cellule progenitrici mononucleari circolanti locali in pazienti trattati con angioplastica con ischemia degli arti critici
Summary
L’amputazione degli arti inferiori può verificarsi anche dopo l’angioplastica dei vasi ostruite nell’ischemia degli arti critici (CLI). Le cellule progenitrici mononucleari (MPC) riflettono la riparazione vascolare. Il presente protocollo descrive la quantificazione degli MPC dalla circolazione vicina all’angioplastica e la sua relazione con la disfunzione endoteliale e la previsione dell’amputazione degli arti inferiori.
Abstract
L’ischemia degli arti critici (CLI) rappresenta uno stadio avanzato della malattia arteriosa periferica. L’angioplastica migliora il flusso sanguigno all’arto inferiore; tuttavia, alcuni pazienti progrediscono irreversibilmente verso l’amputazione degli arti. L’entità del danno vascolare e i meccanismi di riparazione vascolare sono fattori che influenzano l’esito post-angioplastica. Le cellule progenitrici mononucleari (MPC) sono reattive ai danni vascolari e alla riparazione, con la capacità di riflettere le malattie vascolari. Il presente protocollo descrive la quantificazione degli MPC ottenuti dalla circolazione sanguigna dal vaso vicino al sito di angioplastica, così come la sua relazione con la disfunzione endoteliale e la sua capacità predittiva per l’amputazione degli arti nei prossimi 30 giorni dopo l’angioplastica nei pazienti con CLI.
Introduction
La malattia arteriosa periferica (PAD) è caratterizzata da un’ostruzione vascolare cronica e progressiva con limitazione dell’apporto disangue 1. Su scala globale, il PAD degli arti inferiori colpisce circa il 10% della popolazione anziana, mentre fino al 7% di questi casi sono sottoposti all’amputazione degliarti 2,3.
Critical Limb Ischemia (CLI) rappresenta la presentazione più seria di PAD1. I pazienti di solito provano dolore a riposo, ulcere o cancrena attribuibili a arterie occluse; mentre la prognosi clinica è sfavorevole e caratterizzata da un rischio del 30% di amputazione e mortalità degli arti durante 1anno 3,4,5.
L’angioplastica è una procedura endovascolare mininvasiva in grado di ripristinare il flusso sanguigno all’arto inferiore nei pazienti con CLI; tuttavia, alcuni pazienti richiederanno inevitabilmente un’amputazione degli arti maggiore, anche dopo la terapia con angioplastica1,5. L’identificazione precoce di esiti sfavorevoli dopo l’angioplastica è piuttosto preziosa, a causa della possibilità di applicazione della terapia.
I fattori di rischio tradizionali possono fornire una capacità predittiva limitata per l’amputazione degli arti principali in pazienti con CLI sottoposti ad angioplastica6. I biomarcatori orientati alla fisiopatologia rappresentano nuovi metodi con potenziali applicazioni cliniche, che possono risultare specificamente utili nelle malattie legate alla lesione vascolare7. Al giorno d’oggi, la partecipazione delle popolazioni cellulari proprietarie di proprietà di riparazione endoteliale, nel sito della placca aterosclerotica, è statasempre più riconosciuta 8,9.
Le cellule progenitrici mononucleari (MPC) derivano dal midollo osseo e possiedono caratteristiche strutturali e funzionali delle cellule staminali con capacità rigenerative vascolari. Grazie alla capacità di MPC di proliferare, migrare e mostrare aderenza vascolare; queste cellule sono diventate buoni candidati per riflettere la riparazione endoteliale in risposta all’ischemia10,11,12. Inoltre, il continuo interesse per i meccanismi alla base della lesione vascolare ha motivato l’esplorazione del ruolo prognostico dei biomarcatori locali, poiché sono considerati come fattori di assicurazione eriparazione 7,13,14.
Lo scopo del presente studio è quello di descrivere come determinare la quantità di MPC che circolano vicino all’ostruzione vascolare nei pazienti con CLI sottoposti ad angioplastica; e come valutare la relazione tra MPC con indicatori di disfunzione endoteliale e amputazione degli arti.
Rispetto alla prognosi basata su comorbilità e caratteristiche vascolari intrinseche, la quantità di MPC locali mostra una capacità specifica di prevedere l’esito clinico per quanto riguarda la disfunzione endoteliale e l’amputazione degli arti. Coerentemente, alcuni studi hanno descritto il ruolo prognostico di biomarcatori simili durante la valutazione dei pazienti con PAD15,16.
Sulla base dei risultatiprecedenti 7, il metodo qui descritto può essere utile per un’identificazione precoce della popolazione a rischio di esiti vascolari avversi in diversi contesti clinici, come ischemia degli arti inferiori e coronarica, ictus, vascolari, trombosi venosa e altri che comportano lesioni vascolari e riparazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La raccolta del sangue nel sito preciso del blocco vascolare può mostrare difficoltà tecniche; pertanto, abbiamo eseguito la raccolta del sangue in prossimità del blocco vascolare. Allo stesso modo, la quantità di MPC vicino alla placca vascolare sembra essere altamente dinamica e può originare variazioni prima e dopo l’angioplastica. Secondo le nostre osservazioni, si raccomanda di valutare i cambiamenti di basale e 30 minuti dopo l’angioplastica nel numero di MPC, poiché possono riflettere diversi processi fisiop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il supporto del Programma Istituzionale E015 per il progetto ID 356.2015.
Materials
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12×75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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