Prever amputação usando células progenitoras mononucleares circulantes locais em pacientes tratados com angioplastia com isquemia de membros críticos
Summary
A amputação de membros inferiores pode ocorrer mesmo após a angioplastia de vasos obstruídos em Isquemia de Membros Críticos (CLI). Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) refletem o reparo vascular. O presente protocolo descreve a quantificação de CMS de circulação próxima à angioplastia, e sua relação com disfunção endotelial e previsão de amputação de membros inferiores.
Abstract
Isquemia de membros críticos (CLI) representa um estágio avançado da doença arterial periférica. A angioplastia melhora o fluxo sanguíneo para o membro inferior; no entanto, alguns pacientes irreversivelmente progredir para amputação de membros. A extensão dos danos vasculares e os mecanismos de reparação vascular são fatores que afetam o desfecho pós-angioplastia. As Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) são reativas a danos vasculares e reparos, com a capacidade de refletir doenças vasculares. O presente protocolo descreve a quantificação de CMS obtidos a partir da circulação sanguínea de um vaso próximo ao local da angioplastia, bem como sua relação com a disfunção endotelial e sua capacidade preditiva para amputação de membros nos próximos 30 dias após a angioplastia em pacientes com CLI.
Introduction
A Doença Arterial Periférica (PAD) é caracterizada por obstrução vascular crônica e progressiva com limitação do fornecimento de sangue1. Em escala global, o PAD dos membros inferiores afeta cerca de 10% da população idosa, enquanto até 7% desses casos são submetidos à amputação de membros2,3.
Isquemia de Membros Críticos (CLI) representa a apresentação mais séria do PAD1. Os pacientes geralmente sentem dor em repouso, úlceras ou gangrena atribuíveis a artérias ocluídas; enquanto o prognóstico clínico é desfavorável e marcado por um risco de 30% de amputação e mortalidade dos membros durante 1 ano3,4,5.
A angioplastia é um procedimento endovascular minimamente invasivo que pode restaurar o fluxo sanguíneo para o membro inferior em pacientes com CLI; no entanto, alguns pacientes inevitavelmente exigirão amputação de membros principais, mesmo após a terapia de angioplastia1,5. A identificação precoce de desfechos desfavoráveis após a angioplastia é bastante valiosa, devido à possibilidade de aplicação da terapia.
Fatores de risco tradicionais podem fornecer uma capacidade preditiva limitada para amputação de membros principais em pacientes com CLI submetido à angioplastia6. Biomarcadores orientados à fisiopatologia representam novos métodos com aplicações clínicas potenciais, o que pode resultar especificamente útil em doenças relacionadas à lesão vascular7. Atualmente, a participação de populações celulares proprietárias de propriedades de reparo endotelial, no local da placa aterosclerótica, tem sido cada vez mais reconhecida8,9.
As Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) são derivadas da medula óssea e possuem características estruturais e funcionais de células-tronco com habilidades regenerativas vasculares. Devido à capacidade do MPC de proliferar, migrar e mostrar adesão vascular; essas células tornaram-se bons candidatos para refletir o reparo endotelial em resposta à isquemia10,11,12. Além disso, o interesse contínuo por mecanismos subjacentes à lesão vascular tem motivado a exploração do papel prognóstico dos biomarcadores locais, uma vez que são considerados para refletir danos vasculares e reparar7,13,14.
O objetivo do presente estudo é descrever como determinar a quantidade de MPCs que circulam perto da obstrução vascular em pacientes com CLI submetidos à angioplastia; e como avaliar a relação entre ASCs com indicadores de disfunção endotelial e amputação de membros.
Em comparação com o prognóstico baseado em comorbidades e características vasculares intrínsecas, a quantidade de MPCs locais mostram capacidade específica de prever o desfecho clínico em relação à disfunção endotelial e amputação de membros. Consistentemente, alguns estudos descreveram o papel prognóstico de biomarcadores semelhantes durante a avaliação de pacientes com PAD15,16.
Com base em resultados anteriores7, o método descrito aqui pode ser útil para uma identificação precoce da população em risco de desfechos vasculares adversos em diversos ambientes clínicos, como isquemia de membros inferiores e coronárias, acidente vascular cerebral, vasculite, trombose venosa e outros envolvendo lesão vascular e reparação.
Protocol
Representative Results
Discussion
A coleta de sangue no local exato do bloco vascular pode apresentar dificuldades técnicas; por isso, realizamos coleta de sangue nas proximidades do bloco vascular. Da mesma forma, a quantidade de MPCs próximos à placa vascular parece ser altamente dinâmica e pode originar variações antes e depois da angioplastia. De acordo com nossas observações, recomenda-se avaliar as alterações de linha de base e 30min pós-angioplastia no número de MPCs, uma vez que podem refletir diversos processos fisiofisiológicos que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio do Programa Institucional E015 pelo projeto ID 356.2015.
Materials
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12×75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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