Predicción de la amputación utilizando células progenitoras mononucleares circulantes locales en pacientes tratados con angioplastia con isquemia de extremidades críticas
Summary
La amputación de miembros inferiores puede ocurrir incluso después de la angioplastia de vasos obstruidos en isquemia de extremidades críticas (CLI). Las células progenitoras mononucleares (MPC) reflejan la reparación vascular. El protocolo actual describe la cuantificación de los MPCs de la circulación cercana a la angioplastia, y su relación con la disfunción endotelial y la predicción de la amputación de las extremidades inferiores.
Abstract
La isquemia crítica de las extremidades (CLI) representa una etapa avanzada de la enfermedad arterial periférica. La angioplastia mejora el flujo sanguíneo a la extremidad inferior; sin embargo, algunos pacientes progresan irreversiblemente a la amputación de extremidades. El alcance del daño vascular y los mecanismos de reparación vascular son factores que afectan el resultado posterior a la angioplastia. Las células progenitoras mononucleares (MPC) son reactivas para el daño vascular y la reparación, con la capacidad de reflejar enfermedades vasculares. El protocolo actual describe la cuantificación de los MPCs obtenidos de la circulación sanguínea de los vasos cercanos al sitio de la angioplastia, así como su relación con la disfunción endotelial y su capacidad predictiva para la amputación de extremidades en los próximos 30 días después de la angioplastia en pacientes con CLI.
Introduction
Enfermedad arterial periférica (PAD) se caracteriza por una obstrucción vascular crónica y progresiva con limitación del suministro de sangre1. A escala mundial, pad de las extremidades inferiores afecta a alrededor del 10% de la población de edad avanzada, mientras que hasta el 7% de estos casos se someten a la amputación de extremidades2,3.
La isquemia de las extremidades críticas (CLI) representa la presentación más seria del PAD1. Por lo general, los pacientes experimentan dolor en reposo, úlceras o gangrena atribuible a arterias ocluidas; mientras que el pronóstico clínico es desfavorable y marcado por un 30% de riesgo de amputación y mortalidad de extremidades durante 1 año3,4,5.
La angioplastia es un procedimiento endovascular mínimamente invasivo que puede restaurar el flujo sanguíneo a la extremidad inferior en pacientes con CLI; sin embargo, algunos pacientes inevitablemente requerirán una amputación importante de las extremidades, incluso después de la terapia de angioplastia1,5. La identificación temprana de resultados desfavorables después de la angioplastia es bastante valiosa, debido a la posibilidad de la aplicación de la terapia.
Los factores de riesgo tradicionales pueden proporcionar una capacidad predictiva limitada para la amputación de extremidades principales en pacientes con CLI sometidos a angioplastia6. Los biomarcadores orientados a la fisiopatología representan métodos novedosos con aplicaciones clínicas potenciales, que pueden resultar específicamente útiles en enfermedades relacionadas con lesiones vasculares7. Hoy en día, la participación de poblaciones celulares propietarias de propiedades de reparación endotelial, en el sitio de la placa aterosclerótica, ha sido cada vez más reconocida8,9.
Las células progenitoras mononucleares (MPC) se derivan de la médula ósea y de las características estructurales y funcionales propias de las células madre con capacidades regenerativas vasculares. Debido a la capacidad de MPC para proliferar, migrar y mostrar adherencia vascular; estas células se han convertido en buenos candidatos para reflejar la reparación endotelial en respuesta a la isquemia10,11,12. Además, el continuo interés por los mecanismos que subyacen a lesiones vasculares ha motivado la exploración del papel pronóstico de los biomarcadores locales, ya que se considera que reflejan daños vasculares y reparación7,13,14.
El propósito del presente estudio es describir cómo determinar la cantidad de MPCs que circulan cerca de la obstrucción vascular en pacientes con CLI sometidos a angioplastia; y cómo evaluar la relación entre los MPCs con indicadores de disfunción endotelial y amputación de extremidades.
En comparación con el pronóstico basado en comorbilidades y rasgos vasculares intrínsecos, la cantidad de MPCs locales muestra una capacidad específica para predecir el resultado clínico con respecto a la disfunción endotelial y la amputación de extremidades. Consistentemente, algunos estudios han descrito el papel pronóstico de biomarcadores similares durante la evaluación de pacientes con PAD15,16.
Basado en resultados anteriores7, el método descrito aquí puede ser útil para una identificación temprana de la población en riesgo de resultados vasculares adversos en varios entornos clínicos, tales como isquemia coronaria y miembro inferior, accidente cerebrovascular, vasculitis, trombosis venosa y otros que implican lesiones vasculares y reparación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La recolección de sangre en el sitio preciso del bloque vascular puede mostrar dificultades técnicas; por lo tanto, realizamos la recolección de sangre en las proximidades al bloque vascular. Del mismo modo, la cantidad de MPCs cerca de la placa vascular parece ser altamente dinámica y puede originar variaciones antes y después de la angioplastia. De acuerdo con nuestras observaciones, se recomienda evaluar los cambios de referencia y 30min-post-angioplastia en el número de MPCs, ya que pueden reflejar varios proce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo del Programa Institucional E015 para el proyecto ID 356.2015.
Materials
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12×75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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