Systemanalyse der neuroinflammatorischen und hämodynamischen Reaktion auf traumatische Hirnverletzungen

Summary

Dieses Protokoll stellt Methoden vor, um die neuroinflammatorische und hämodynamische Reaktion auf leichte traumatische Hirnverletzungen zu charakterisieren und diese Daten als Teil einer multivariaten Systemanalyse unter Verwendung der partiellen Regression der kleinsten Quadrate zu integrieren.

Abstract

Leichte traumatische Hirnverletzungen (mTBIs) sind ein erhebliches Problem der öffentlichen Gesundheit. Eine wiederholte Exposition gegenüber mTBI kann zu kumulativen, lang anhaltenden funktionellen Defiziten führen. Zahlreiche Studien unserer Gruppe und anderer haben gezeigt, dass mTBI die Zytokinexpression stimuliert und Mikroglia aktiviert, den zerebralen Blutfluss und Stoffwechsel verringert und die zerebrovaskuläre Reaktivität beeinträchtigt. Darüber hinaus haben mehrere Arbeiten über einen Zusammenhang zwischen Störungen in diesen neuroinflammatorischen und hämodynamischen Markern und kognitiven Beeinträchtigungen berichtet. Hierin beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung der neuroinflammatorischen und hämodynamischen Gewebereaktion auf mTBI bei Mäusen. Insbesondere beschreiben wir, wie man ein Gewichtsverlustmodell von mTBI durchführt, wie man den zerebralen Blutfluss mit einer nicht-invasiven optischen Technik namens diffuse Korrelationsspektroskopie longitudinal misst und wie man einen Luminex-Multiplex-Immunoassay an Hirngewebeproben durchführt, um Zytokine und immunmodulatorische Phospho-Proteine (z. B. innerhalb der MAPK- und NFκB-Signalwege) zu quantifizieren, die auf Mikroglia und andere neuronale Immunzellen reagieren und diese regulieren. Schließlich beschreiben wir, wie diese Daten mithilfe eines multivariaten Systemanalyseansatzes integriert werden können, um die Beziehungen zwischen all diesen Variablen zu verstehen. Das Verständnis der Beziehungen zwischen diesen physiologischen und molekularen Variablen wird es uns letztendlich ermöglichen, Mechanismen zu identifizieren, die für mTBI verantwortlich sind.

Introduction

Überblick
Leichte traumatische Hirnverletzungen (mTBIs) betreffen jährlich ~ 1,6-3,8 Millionen Athleten¹. Diese Verletzungen, einschließlich subkonzersiver und erschütternder Verletzungen, können Patienten mit vorübergehenden körperlichen, emotionalen, psychischen und kognitiven Symptomen^{zurücklassen 2}. Darüber hinaus können sich wiederholende mTBI (rmTBI), die innerhalb eines “Fensters der Vulnerabilität” aufrechterhalten werden, zu einer kumulativen Schwere und Dauer kognitiver Konsequenzen führen, die länger anhalten als die Auswirkungen eines einzelnen mTBI^{allein 3, und} letztendlich sogar zu einem dauerhaften Funktionsverlust ^4,5,6. Obwohl sich viele Patienten innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums ( 1 Monat unter länger anhaltenden Auswirkungen von mTBI, wobei einige bis zu 1 Jahr 3,7,8,9 dauern. Trotz der hohen Prävalenz und der dauerhaften Folgen dieser Verletzungen sind die Verletzungsmechanismen schlecht verstanden und es gibt keine wirksamen Behandlungsstrategien.

Angesichts der hohen Variabilität der Endpunkte nach mTBI/rmTBI besteht eine Herausforderung bei der Identifizierung molekularer Auslöser im Frühstadium aus Gewebe, das in terminalen mTBI/rmTBI-Studien erhalten wurde, in dem Mangel an Längsschnittdaten, die definitive “akute molekulare Verbindungen” dieser molekularen Auslöser zu längerfristigen Ergebnissen belegen. Um diese Herausforderung zu meistern, hat unsere Gruppe entdeckt, dass akut reduzierter zerebraler Blutfluss, der akut mit einem optischen Werkzeug namens diffuse Korrelationsspektroskopie (DCS) gemessen wurde, stark mit längerfristigen kognitiven Ergebnissen in einem Mausmodell von^{rmTBI 10} korreliert. Unter Verwendung dieses hämodynamischen Biomarkers zeigten wir, dass Mäuse mit akut niedrigem zerebralem Blutfluss (und damit einem schlechteren vorhergesagten Langzeitergebnis) einen gleichzeitigen akuten Anstieg der neuronalen Phospho-Signalgebung sowohl innerhalb des MACK- als auch des NFκB-Signalwegs, eine Zunahme der neuronalen Expression von proinflammatorischen Zytokinen und eine Zunahme der Expression des Phagozyten-/Mikrogliamarkers Iba1¹¹ aufweisen. . Diese Daten deuten auf eine mögliche Rolle für die neuronale Phospho-Signalgebung, die Zytokinexpression und die Mikrogliaaktivierung sowohl bei der akuten Regulation des zerebralen Blutflusses nach der Verletzung als auch bei der Auslösung einer Signalkaskade hin, die zu neuronaler Dysfunktion und schlechteren kognitiven Ergebnissen führt. Hierin beschreiben wir unseren Ansatz, sowohl die hämodynamische als auch die neuroinflammatorische Umgebung nach rTBI gleichzeitig zu untersuchen und diese komplexen Datensätze zu integrieren. Insbesondere skizzieren wir Verfahren für vier Schlüsselschritte zu diesem umfassenden Ansatz: (1) ein Gewichtsverlustmodell für leichte traumatische Hirnverletzungen, (2) Bewertung des zerebralen Blutflusses mit diffuser Korrelationsspektroskopie, (3) Quantifizierung der neuroinflammatorischen Umgebung und (4) Datenintegration (Abbildung 1). Im Folgenden finden Sie eine kurze Einführung in jeden dieser wichtigen Schritte, um die Leser durch die Gründe für unsere Methoden zu führen. Der Rest des Manuskripts enthält ein detailliertes Protokoll für jeden dieser Schlüsselschritte.

Gewichtsverlustmodell der leichten traumatischen Hirnverletzung
Obwohl viele ausgezeichnete präklinische Modelle für sich wiederholende leichte TBI existieren 12,13,14,15,16,17,18, verwenden wir ein gut etabliertes und klinisch relevantes Gewichtsabfall-geschlossenes Kopfverletzungsmodell. Zu den Hauptmerkmalen dieses Modells gehören (1) stumpfe Auswirkungen des intakten Schädels / der Kopfhaut, gefolgt von einer uneingeschränkten Rotation des Kopfes um den Hals, (2) keine offene strukturelle Hirnverletzung, Ödeme, Blut-Hirn-Schranken-Schäden, akuter Zelltod oder chronischer Hirngewebeverlust und (3) anhaltende (bis zu 1 Jahr) kognitive Defizite, die erst nach mehreren^{Treffern auftreten 19} (Abbildung 2).

Beurteilung des zerebralen Blutflusses mit diffuser Korrelationsspektroskopie
Die diffuse Korrelationsspektroskopie (DCS) ist eine nicht-invasive optische Technik, die den Blutfluss ^5,20,21 misst. Bei DCS wird eine Nahinfrarot-Lichtquelle auf der Gewebeoberfläche platziert. Ein Detektor wird in einem festen Abstand von der Quelle auf der Gewebeoberfläche platziert, um Licht zu erkennen, das sich durch das Gewebe vermehrt hat (Abbildung 3). Die Streuung von sich bewegenden roten Blutkörperchen führt dazu, dass die erkannte Lichtintensität mit der Zeit schwankt. Ein einfaches analytisches Modell, das als Korrelationsdiffusionstheorie bekannt ist, wird verwendet, um diese Intensitätsschwankungen mit einem Index des Blutflusses in Beziehung zu setzen (CBF_i, Abbildung 4). Obwohl die Einheiten von CBF i (cm² / s) nicht die traditionellen Flusseinheiten (ml / min / 100 g) sind, hat eine frühere Studie an Mäusen gezeigt, dass CBF_i stark mit dem zerebralen Blutfluss korreliert, der durch den arteriellen Spin gemessen wird, der mit MRT²¹ markiert ist.

Als Referenz wurde das hier verwendete DCS-Instrument im eigenen Haus gebaut und besteht aus einem 852 nm langen Kohärenz-Längenlaser, einem Array von 4 Photonenzähl-Lawinen-Photodioden und einer Hardware-Autokorrelatorplatine (einzelne Tau, 8 Kanäle, 100 ns minimale Abtastzeit)^21,22. Die Daten werden mit hausgemachter Software erfasst, die in LabView geschrieben ist. Die Tierschnittstelle für das Gerät besteht aus einer 400 μm Multimode-Quellfaser (400-2200 nm Wellenlängenbereich, reiner Kieselsäurekern, TECS Hard Cladding) und einer 780 nm Singlemode-Detektorfaser (780-970 nm Wellenlängenbereich, reiner Kieselsäurekern, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm Sekundenmodus-Cut-off) im Abstand von 6 mm und eingebettet in einen schwarzen 3D-gedruckten Sensor (4 mm x 8 mm, Abbildung 3).

Quantifizierung des neuroinflammatorischen Umfelds
Obwohl die Neuroinflammation durch verschiedene zelluläre Prozesse reguliert wird, sind zwei wichtige relevante Mechanismen die extrazelluläre Signalübertragung durch Zytokine/Chemokine und die intrazelluläre Signalübertragung durch Phospho-Proteine. Um die neuroinflammatorische Umgebung des Gehirns nach einer Verletzung zu untersuchen, werden Gehirne aus Mäusen extrahiert, mikrodissektiert und Zytokine/Chemokine und Phosphoproteine mit Luminex quantifiziert (Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7). Luminex-Multiplex-Immunoassays ermöglichen die gleichzeitige Quantifizierung einer vielfältigen Sammlung dieser Proteine, indem enzymgebundene Immunsorbentien-Assays (ELISAs) an fluoreszierend markierte magnetische Kügelchen gekoppelt werden. Für jedes Protein von Interesse werden unterschiedliche fluoreszierende Tags verwendet, und die Perlen jedes Tags werden mit einem Capture-Antikörper gegen dieses bestimmte Protein funktionalisiert. Hunderte von Perlen zur Erfassung jedes Proteins werden miteinander vermischt, in eine 96-Well-Platte gelegt und mit Proben inkubiert. Nach der Probeninkubation wird ein Magnet verwendet, um die Perlen im Brunnen einzufangen, während die Probe ausgewaschen wird. Als nächstes bindet der biotinylierte Detektionsantikörper an den interessierenden Analyten, um ein Antikörper-Antigen-Sandwich ähnlich einem traditionellen ELISA zu bilden, jedoch mit dem ELISA für jedes Protein, das auf einer anderen fluoreszierend markierten Perle auftritt. Die Zugabe von Phycoerythrin-konjugiertem Streptavidin (SAPE) schließt jede Reaktion ab. Das Luminex-Instrument liest dann die Perlen und trennt das Signal nach jedem fluoreszierenden Tag / Protein.

Datenintegration
Aufgrund der großen Anzahl von Analyten (z. B. Zytokinen), die im Luminex-Assay gemessen wurden, kann die Datenanalyse schwierig zu interpretieren sein, wenn jedes quantifizierte Protein einzeln analysiert wird. Um die Analyse zu vereinfachen und Trends zu erfassen, die bei Analyten beobachtet wurden, verwenden wir eine multivariate Analysemethode, die als partielle Regression der kleinsten Quadrate bezeichnet wird (PLSR, Abbildung 8)²³. PLSR funktioniert, indem es eine Achse von Gewichten identifiziert, die jedem gemessenen Protein entsprechen (d. h. Zytokine oder Phosphoproteine, die als “Prädiktorvariablen” bezeichnet werden), die zusammen die Kovarianz der gemessenen Proteine mit einer Antwortvariablen (z. B. zerebraler Blutfluss) optimal erklären. Die Gewichte werden als “Lasten” bezeichnet und zu einem Vektor zusammengefasst, der als latente Variable (LV) bezeichnet wird. Durch die Projektion (als “Scoring” bezeichnet) der gemessenen Proteindaten auf jedes der beiden LVs können die Daten in Bezug auf diese LVs neu dargestellt werden. Nach der Berechnung der PLSR verwenden wir eine Varimax-Rotation, um eine neue LV zu identifizieren, die die Kovarianz zwischen den Stichprobenprojektionen auf den LV und die Prädiktorvariable²⁴ maximiert. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, LV1 als die Achse zu definieren, für die die Varianz der Antwortvariablen am besten erklärt wird. LV2 maximiert die Kovarianz zwischen der Antwortvariablen und den LV1-Restdaten, die mit biologischer oder technischer Variabilität zwischen den Proben verbunden sein können. Schließlich führen wir eine Leave One Out Cross Validation (LOOCV) durch, um sicherzustellen, dass das PLSR-Modell nicht stark von einer Stichprobe^{abhängig ist 23}.

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung der neuroinflammatorischen und hämodynamischen Gewebereaktion auf mTBI. Der allgemeine Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. In diesem Protokoll unterliegen Mäuse einem oder mehreren mTBIs unter Verwendung eines Gewichtsverlust-geschlossenen Kopfverletzungsmodells. Der zerebrale Blutfluss wird vor und zu mehreren Zeitpunkten nach der Verletzung in Längsrichtung gemessen. Zum Zeitpunkt des Interesses für die Befragung von neuroinflammatorischen Veränderungen wird das Tier eingeschläfert und das Gehirn wird extrahiert. Hirnregionen von Interesse werden mittels Mikrodissektion isoliert und dann lysiert, um Protein zu extrahieren. Lysate werden dann sowohl für Luminex Multiplex-Immunoassays der Zytokin- und Phosphoproteinexpression als auch für Western Blot verwendet. Schließlich wird dieser ganzheitliche Datensatz mithilfe einer partiellen Regressionsanalyse der kleinsten Quadrate integriert.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und befolgten die NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Gewichtsverlustmodell der leichten traumatischen Hirnverletzung Bereiten Sie das Weight-Drop-Setup vor. Montieren Sie einen Schraubstock auf einer ebenen Fläche mit einem 1 m langen Führungsrohr (2,54 cm Innendurchmesser), das vertikal ausgerichtet ist (Überprüfung mit einer Ebene). Verwen…

Representative Results

Zuvor gesammelte Daten stammen aus früheren Arbeiten, bei denen eine Gruppe von acht C57BL/6-Mäusen drei Verletzungen mit geschlossenem Kopf (Abbildung 2) im Abstand von einmal täglich11 ausgesetzt war. In dieser Arbeit wurde der zerebrale Blutfluss mit diffuser Korrelationsspektroskopie 4 h nach der letzten Verletzung gemessen (Abbildung 3, Abbildung 4). Nach der CBF-Beurteilung nach der Verletzung wurden…

Discussion

Hierin beschreiben wir Methoden zur Beurteilung der hämodynamischen und neuroinflammatorischen Reaktion auf wiederholte leichte traumatische Hirnverletzungen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, wie diese Daten im Rahmen einer multivariaten Systemanalyse mit partieller Regression der kleinsten Quadrate integriert werden können. Im folgenden Text werden wir einige der wichtigsten Schritte und Einschränkungen im Zusammenhang mit dem Protokoll sowie die Vor- und Nachteile der Methoden gegenüber bestehenden Methoden disku…

Materials

Adjustable pipettes			any adjustable pipette
Aluminum foil	VWR	89107-726
Bio-Plex cell lysis kit	C Bio-Rad	171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile	BrandTech	781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet	Sigma-Aldrich	11836153001
Depilatory cream	Amazon	Nair
DiH2O	VWR	VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates	Millipore Sigma Catalogue	40-285
Hardware Autocorrelator Board	www.correlator.com	Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL	MED-VET INTERNATIONAL	RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm)	VWR	21905-026
Laboratory vortex mixer	VWR	10153-838
LabView	National Instruments	LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software	Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid	Luminex	MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid	EMD Millipore	SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay	Millipore Sigma	MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay	Millipore Sigma	48-660MAG
Mini LabRoller rotator	VWR	10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS)	VWR	97064-158
Plate Sealer	VWR	82050-992
Polypropylene microfuge tubes	VWR	20901-547
Mini LabRoller	Millipore Sigma	Z674591
Reagent Reservoirs	VWR	89094-668
R Programming Language
RStudio	www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker	VWR	12620-926
Tween20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
1 m acrylic guide tube	McMaster-Carr	49035K85
4 photon counting avalanche photodiode	Perkin-Elmer	SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber	Thorlabs Inc.	FT-400-EMT
54 g bolt	Ace Hardware		0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber	Thorlabs Inc.	780HP
852 nm long-coherence length laser	TOPTICA Photonics	iBeam smart