외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응의 시스템 분석
Summary
이 프로토콜은 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응을 특성화하고 부분 최소 제곱 회귀를 사용하는 다변량 시스템 분석의 일부로 이러한 데이터를 통합하는 방법을 제시합니다.
Abstract
경미한 외상성 뇌 손상 (mTBIs)은 중요한 공중 보건 문제입니다. mTBI에 반복적으로 노출되면 누적적이고 오래 지속되는 기능 결핍이 발생할 수 있습니다. 우리 그룹과 다른 사람들의 수많은 연구에 따르면 mTBI는 사이토 카인 발현을 자극하고 미세 아교세포를 활성화시키고 뇌 혈류와 신진 대사를 감소시키고 뇌 혈관 반응성을 손상시킵니다. 또한, 몇몇 연구는 이러한 신경 염증 및 혈역학 마커의인지 장애의 혼란과 연관성을보고했습니다. 본원에서 우리는 마우스에서 mTBI에 대한 신경염증 및 혈역학적 조직 반응을 특성화하는 방법을 상세히 설명한다. 구체적으로, 우리는 mTBI의 중량 감소 모델을 수행하는 방법, 확산 상관 분광법이라고 불리는 비침습적 광학 기술을 사용하여 뇌 혈류를 종방향으로 측정하는 방법, 그리고 미세아교세포 및 기타 신경 면역 세포의 활성에 반응하고 조절하는 사이토카인 및 면역조절 포스포 단백질(예를 들어, MAPK 및 NFκB 경로 내)을 정량화하기 위해 뇌 조직 샘플에 대해 루미넥스 다중화 면역검정을 수행하는 방법을 설명한다. 마지막으로 다변량 시스템 분석 접근 방식을 사용하여 이러한 데이터를 통합하여 이러한 모든 변수 간의 관계를 이해하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 생리 변수와 분자 변수 간의 관계를 이해하면 궁극적으로 mTBI를 담당하는 메커니즘을 식별 할 수 있습니다.
Introduction
개요
경미한 외상성 뇌 손상 (mTBIs)은 ~ 1.6-3.8 백만 운동 선수에게 매년 영향을 미칩니다1. 뇌진탕 하 및 뇌진탕 부상을 포함한 이러한 부상은 일시적인 신체적, 정서적, 심리적 및인지 적 증상을 가진 환자를 떠날 수 있습니다2. 더욱이, “취약성의 창” 내에서 지속되는 반복적인 mTBI(rmTBI)는 단일 mTBI 단독의 효과보다 더 오래 지속되는 인지적 결과의 누적된 심각도 및 지속기간을 야기할 수 있고, 궁극적으로는 기능(4,5,6)의 영구적인 손실로 이어질 수 있다. 많은 환자들이 비교적 짧은 기간 ( 1 개월 동안 mTBI의 더 오래 지속되는 효과를 겪으며 일부는 1 년까지 지속됩니다 3,7,8,9. 이러한 부상의 높은 유병률과 지속적인 결과에도 불구하고 부상 메커니즘은 제대로 이해되지 않으며 효과적인 치료 전략이 존재하지 않습니다.
mTBI / rmTBI 이후의 결과의 높은 변동성을 감안할 때, 말단 mTBI / rmTBI 연구에서 얻은 조직으로부터 초기 단계 분자 트리거를 식별하는 데있어 한 가지 과제는 이러한 분자 트리거의 결정적인 “급성 분자 연결”을 보여주는 종단 데이터가 부족하다는 것입니다. 이 도전을 극복하기 위해 우리 그룹은 확산 상관 분광법 (DCS)이라는 광학 도구를 사용하여 급격하게 측정 된 급격하게 감소 된 뇌 혈류가 rmTBI10의 마우스 모델에서 장기적인인지 결과와 강하게 관련이 있음을 발견했습니다. 이 혈역학적 바이오마커를 사용하여, 우리는 뇌혈류가 급격히 낮은 마우스(그리고 확장에 의해, 더 나쁜 예측된 장기적 결과)를 가진 마우스가 MAPK 및 NFκB 경로 둘 다에서 뉴런 포스포-신호전달의 수반되는 급성 증가, 전염증성 사이토카인의 뉴런 발현의 증가, 식세포/미세아교세포 마커 Iba111의 발현 증가를 나타냈다. . 이러한 데이터는 신경 포스포 신호전달, 사이토카인 발현 및 미세아교세포 활성화에 대한 가능한 역할을 시사하며, 손상 후 뇌혈류의 급성 조절뿐만 아니라 뉴런 기능 장애 및 더 나쁜인지 결과를 초래하는 신호전달 캐스케이드를 촉발시키는 데 있다. 여기에서는 rmTBI 후 혈역학적 및 신경 염증 환경을 동시에 조사하는 방법과 이러한 복잡한 데이터 세트를 통합하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 구체적으로, 우리는이 포괄적 인 접근법에 대한 네 가지 주요 단계에 대한 절차를 간략하게 설명합니다 : (1) 경미한 외상성 뇌 손상의 체중 감소 모델, (2) 확산 상관 분광법을 통한 뇌 혈류 평가, (3) 신경 염증 환경의 정량화 및 (4) 데이터 통합 (그림 1). 아래에서는 이러한 주요 단계 각각에 대한 간략한 소개를 제공하여 독자가 우리의 방법의 근거를 안내하는 데 도움을줍니다. 원고의 나머지 부분은 이러한 각 주요 단계에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
가벼운 외상성 뇌 손상의 체중 감소 모델
반복적 인 경증 TBI의 많은 우수한 전임상 모델이 존재하지만 12,13,14,15,16,17,18, 우리는 잘 정립되고 임상 적으로 관련된 체중 감소 폐쇄 두부 손상 모델을 사용합니다. 이 모델의 주요 특징은 (1) 손상되지 않은 두개골 / 두피의 둔한 충격과 목에 대한 머리의 무제한 회전, (2) 명백한 구조적 뇌 손상, 부종, 혈액 – 뇌 장벽 손상, 급성 세포 사멸 또는 만성 뇌 조직 손실 없음, (3) 여러 번 히트 한 후에 만 나타나는 지속적인(최대 1 년의) 인지 결핍(그림 2)을 포함합니다.
확산 상관 분광법을 통한 뇌 혈류 평가
확산 상관 분광법 (DCS)은 혈류 5,20,21을 측정하는 비 침습적 광학 기술입니다. DCS에서는 근적외선 광원이 조직 표면에 배치됩니다. 검출기는 조직 표면의 소스로부터 고정된 거리에 배치되어 조직을 통해 흩어져있는 빛을 감지합니다 (그림 3). 움직이는 적혈구를 산란하면 감지 된 빛의 세기가 시간에 따라 변동합니다. 상관 확산 이론으로 알려진 간단한 분석 모델은 이러한 강도 변동을 혈류 지수와 관련시키는 데 사용됩니다 (CBFi, 그림 4). CBF i (cm2/s)의 단위가 전통적인 유동 단위 (mL/min/100 g)는 아니지만, 마우스에 대한 이전의 연구는 CBFi가 MRI21로 표지된 동맥 스핀에 의해 측정된 뇌 혈류와 강하게 상관관계가 있음을 보여주었다.
참고로, 여기에 사용된 DCS 계측기는 사내에 제작되었으며 852nm 길이의 일관성 길이 레이저, 4개의 광자 계수 애벌런치 광 다이오드 어레이 및 하드웨어 자동 상관기 기판(단일 타우, 8채널, 100ns 최소 샘플 시간)21,22개로 구성됩니다. 데이터는 LabView로 작성된 수제 소프트웨어로 수집됩니다. 이 장치의 동물 인터페이스는 400 μm 다중 모드 소스 섬유 (400-2200 nm 파장 범위, 순수 실리카 코어, TECS 하드 클래딩) 및 780 nm 단일 모드 검출기 섬유 (780-970 nm 파장 범위, 순수 실리카 코어, TECS 하드 클래딩, 730 ± 30 nm 초 모드 컷오프)로 구성되며 6 mm 간격으로 이격되어 검은 색 3D 인쇄 센서 (4 mm x 8 mm, 그림 3).
신경 염증 환경의 정량화
신경 염증은 다양한 세포 과정에 의해 조절되지만, 두 가지 주요 관련 메커니즘은 사이토 카인 / 케모카인에 의한 세포 외 신호 전달과 포스포 단백질에 의한 세포 내 신호입니다. 손상 후 뇌의 신경 염증 환경을 조사하기 위해 뇌는 생쥐에서 추출되고 미세 해부되며 Luminex를 사용하여 사이토 카인 / 케모카인 및 포스포 단백질이 정량화됩니다 (그림 5, 그림 6, 그림 7). Luminex 다중화 면역검정은 형광 태그가 지정된 자기 비드에 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISAs)을 결합시킴으로써 이러한 단백질의 다양한 수집을 동시에 정량화할 수 있게 합니다. 별개의 형광 태그가 관심있는 각 단백질에 대해 사용되고, 각 태그의 비드는 특정 단백질에 대한 포획 항체로 기능화된다. 각 단백질을 포획하기 위한 수백 개의 비드를 함께 혼합하고, 96 웰 플레이트에 넣고, 샘플과 함께 인큐베이션한다. 샘플 인큐베이션 후, 자석을 사용하여 샘플을 세척하는 동안 웰에 비드를 트랩합니다. 다음으로, 비오티닐화 검출 항체는 관심있는 분석물에 결합하여 전통적인 ELISA와 유사한 항체-항원 샌드위치를 형성하지만, 각각의 단백질에 대한 ELISA와 함께 상이한 형광 태깅된 비드 상에서 발생한다. 피코에리트린-컨쥬게이션된 스트렙타비딘(SAPE)을 첨가하면 각 반응이 완료된다. 그런 다음 Luminex 기기는 비드를 읽고 각 형광 태그/단백질에 따라 신호를 분리합니다.
데이터 통합
Luminex 분석에서 측정된 많은 수의 분석물(예를 들어, 사이토카인)으로 인해, 각각의 정량화된 단백질이 개별적으로 분석된다면 데이터 분석은 해석하기 어려울 수 있다. 분석을 단순화하고 분석물 사이에서 관찰된 경향을 포착하기 위해, 우리는 부분 최소 제곱 회귀(PLSR, 그림 8)23이라는 다변량 분석 방법을 사용합니다. PLSR은 각각의 측정된 단백질(즉, 사이토카인 또는 포스포-단백질, “예측인자 변수”로 지칭됨)에 상응하는 가중치의 축을 확인함으로써 작동하며, 이는 함께 측정된 단백질과 반응 변수(예를 들어, 대뇌 혈류)의 공분산을 최적으로 설명한다. 가중치는 “로딩”이라고 하며 잠복 변수(LV)로 알려진 벡터로 조립됩니다. 측정된 단백질 데이터를 두 LV 각각에 투사(“스코어링”으로 지칭됨)함으로써, 데이터는 이들 LV의 관점에서 재플롯팅될 수 있다. PLSR을 계산한 후, 우리는 변량체 회전을 사용하여 LV에 대한 샘플 프로젝션과 예측 변수24 사이의 공분산을 최대화하는 새로운 LV를 식별한다. 이 접근 방식을 사용하면 LV1을 반응 변수의 분산이 가장 잘 설명되는 축으로 정의 할 수 있습니다. LV2는 반응 변수와 LV1 잔류 데이터 사이의 공분산을 최대화하며, 이는 샘플 간의 생물학적 또는 기술적 변동성과 연관될 수 있다. 마지막으로, 우리는 PLSR 모델이 어느 하나의 샘플(23)에 크게 의존하지 않도록 하기 위해 LOOCV(Leave One Out Cross Validation)를 실시한다.
이 프로토콜에서, 우리는 mTBI에 대한 신경염증 및 혈역학적 조직 반응을 특성화하는 방법을 상세히 설명한다. 일반적인 워크플로는 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜에서, 마우스는 체중 감소 폐쇄 두부 손상 모델을 사용하여 하나 이상의 mTBI를 받는다. 대뇌 혈류는 부상 전과 부상 후 여러 시점에서 종으로 측정됩니다. 신경 염증 변화의 심문에 대한 관심의 시점에서, 동물은 안락사되고, 뇌는 추출된다. 관심있는 뇌 영역은 미세 해부를 통해 분리 된 다음 용해되어 단백질을 추출합니다. 용해물은 이어서 사이토카인 및 포스포-단백질 발현의 루미넥스 다중화 면역검정 및 웨스턴 블롯 둘 다에 사용된다. 마지막으로, 이 전체 론적 데이터 세트는 부분 최소 제곱 회귀 분석을 사용하여 통합됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 반복적 인 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 혈역학 및 신경 염증 반응의 평가를위한 방법을 자세히 설명합니다. 또한 부분 최소 제곱 회귀를 사용하여 이러한 데이터를 다변량 시스템 분석의 일부로 통합하는 방법을 보여 주었습니다. 아래 텍스트에서 우리는 프로토콜과 관련된 몇 가지 주요 단계 및 제한 사항뿐만 아니라 기존 방법에 비해 방법의 장점 / 단점에 대해 논의 할 것입?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) 및 R01 NS115994 (LBW / EB) 및 애틀랜타 주니어 교수진 집중 상 (EMB)의 어린이 건강 관리가 지원했습니다. 이 작업은 또한 미국 국방부가 상 번호 (Award No)에 따라 의회 감독 의료 연구 프로그램을 통해 지원했습니다. W81XWH-18-1-0669 (LBW / EMB). 의견, 해석, 결론 및 권고는 저자의 의견이며 반드시 국방부에서 보증하는 것은 아닙니다. 이 자료는 보조금 번호 1937971에 따라 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에서 지원하는 작업을 기반으로합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
References
- Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
- Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
- Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. . Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury – an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport–the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
- Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
- Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
- Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
- Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
- Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment–part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
- Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury–part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
- Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
- Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
- Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
- Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
- Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
- Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
- Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
- Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
- . plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019)
- White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
- Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
- Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
- Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
- Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).
