Denna metod syftar till att utvärdera biomaterialets cytotoxicitet genom beredning av lösliga extrakt, med hjälp av viabilitetsanalyser och fenotypisk analys, inklusive flödescytometri, RT-PCR, immunocytokemi och andra cellulära och molekylärbiologiska tekniker.
Biomaterial kommer i direkt eller indirekt kontakt med mänskliga vävnader, vilket gör det viktigt att utvärdera dess cytotoxicitet. Denna utvärdering kan utföras med flera metoder, men det finns en hög skillnad mellan de använda metoderna, vilket äventyrar reproducerbarheten och jämförelsen mellan de erhållna resultaten. I detta dokument föreslår vi ett protokoll för att utvärdera biomaterials cytotoxicitet med hjälp av lösliga extrakt, som vi använder för dentala biomaterial. Beredningen av extrakt är detaljerad, från pelletsproduktion till dess extraktion i ett odlingsmedium. Utvärderingen av biomaterialets cytotoxicitet baseras på metabolisk aktivitet med MTT-analysen, cellviabilitet med användning av SBR-analysen (Sulphorhodamine B), celldödsprofil med flödescytometri och cellmorfologi med May-Grünwald Giemsa. Utöver cytotoxicitetsutvärderingen beskrivs ett protokoll för att utvärdera cellfunktionen baserat på uttrycket av specifika markörer bedömda med immunocytokemi och PCR. Detta protokoll ger en omfattande guide för biomaterial cytotoxicitet och cellulära effekter utvärdering, med hjälp av extrakt metodik, på ett reproducerbart och robust sätt.
Biokompatibilitet kan definieras som ett materials förmåga att integrera vävnad och inducera ett gynnsamt terapeutiskt svar, fritt från lokala och systemiska skador 1,2,3. Utvärdering av biokompatibilitet är avgörande för utvecklingen av material som är avsett för medicinskt bruk. Därför ger detta protokoll ett systematiskt och omfattande tillvägagångssätt för varje forskare som syftar till att utveckla nya biomaterial eller studera nya tillämpningar för befintliga biomaterial.
In vitro-cytotoxicitetstester används ofta som den första fasen för utvärdering av biokompatibilitet, med användning av primära cellkulturer eller cellinjer. Resultaten utgör en första indikator på potentiell klinisk tillämpning. Förutom att vara avgörande för utvecklingen av biomaterial är denna testning obligatorisk för att följa gällande regler för marknadsintroduktion, från EUA och EU: s tillsynsmyndigheter (FDA och CE-certifiering) 4,5,6,7,8. Dessutom ger standardiserade tester inom biomedicinsk forskning en betydande fördel när det gäller reproducerbarhet och jämförelse av resultat från olika studier på liknande biomaterial eller produkter9.
Riktlinjer från International Organization for Standardization (ISO) används ofta av flera oberoende kommersiella, reglerande och akademiska laboratorier för att testa material på ett korrekt och reproducerbart sätt. ISO 10993-5 hänvisar till cytotoxicitetsbedömningen in vitro och ISO 10993-12-rapporterna till provtagningspreparatet10,11. För biomaterialtestning tillhandahålls tre kategorier, som ska väljas utifrån materialtyp, kontaktvävnader och behandlingsmålet: extrakt, direktkontakt och indirekt kontakt 8,11,12,13. Extrakt erhålls genom att berika ett cellodlingsmedium med biomaterialet. För direktkontakttesterna placeras biomaterialet direkt på cellkulturerna, och vid indirekt kontakt utförs inkubation med cellerna separerad av en barriär, såsom en agarosgel11. Lämpliga kontroller är obligatoriska och minst tre oberoende experiment bör utföras 5,8,10,11,14.
Det är viktigt att simulera eller överdriva kliniska tillstånd för att bestämma den cytotoxiska potentialen. Vid extraktprovning, materialets yta. medelvolymen; mediet och materialets pH; materialets löslighet, osmolaritet och diffusionsförhållande; och extraktionsförhållandena som omrörning, temperatur och tid påverkar medieberikare5.
Metodiken möjliggör kvantitativ och kvalitativ utvärdering av cytotoxicitet hos flera farmaceutiska formuleringar, både fasta och flytande. Flera analyser kan utföras, såsom neutralt rött upptagstest, kolonibildningstest, MTT-analys och XTT-analys 5,10,14.
De flesta publicerade cytotoxicitetsbedömningsstudier använder enklare analyser, nämligen MTT och XTT, som ger begränsad information. Utvärdering av biokompatibilitet bör inte bara omfatta bedömning av cytotoxicitet utan även bioaktivitet hos ett visst testmaterial2, vilket bekräftas i detta protokoll. Ytterligare utvärderingskriterier bör användas när det är motiverat och dokumenterat. Således syftar detta protokoll till att ge en omfattande guide som beskriver en uppsättning metoder för biomaterialets cytotoxicitetsutvärdering. Dessutom beskrivs utvärderingen av olika cellulära processer, nämligen typ av celldöd, cellmorfologi, cellfunktion vid syntes av specifika proteiner och specifik vävnadsproduktion.
Detta protokoll utformades med hänsyn till ISO 10993-5, som hänvisar till utvärderingen av cytotoxicitet in vitro hos biomaterial som kommer i kontakt med vävnaderna, för att utvärdera biokompatibiliteten och bidra till studiernas reproducerbarhet21. Detta är ett växande problem inom vetenskapen, och många författare följer redan dessa rekommendationer i den experimentella utformningen av sina in vitro-studier 15,22,23,24,25,26,27,28.<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar följande för stöd: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB finansieras av nationella medel via FCT (Foundation for Science and Technology) genom det strategiska projektet UIDB/04539/2020 och UIDP/04539/2020 (CIBB). Vi tackar Jacques Nör, University of Michigan Dental School, för att tillhandahålla cellinjen MDPC-23.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CaCl2 | Sigma | 10035-04-8 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
DAB + Chromogen | Dako | K3468 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 | Santa Cruz Biotechnology | LS-C20939 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Hepes 0.01 M | Sigma | MFCD00006158 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Giemsa Stain, modified GS-500 | Sigma | MFCD00081642 | |
Glycerol | Dako | C0563 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
May-Grünwald Stain MG500 | Sigma | MFCD00131580 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 | Dako | G-21234 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Substrate Buffer | Dako | 926605 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
β-actin antibody | Sigma | A5316 |