Isolation og dyrkning af mandibular knoglemarv mesenchymale stamceller hos rotter
Summary
Denne artikel præsenterer en metode, der kombinerer hele knoglemarvsophæftning og flowcytometrisortering til isolering, dyrkning, sortering og identifikation af knoglemarvsmetrimometriske stamceller fra rotte mandibler.
Abstract
Her præsenterer vi en effektiv metode til isolering og dyrkning af mandibulære knoglemarvsmetrimylceller (mBMSCs) in vitro for hurtigt at opnå mange celler af høj kvalitet til eksperimentelle behov. mBMSCs kunne i vid udstrækning anvendes i terapeutiske anvendelser som vævstekniske celler i tilfælde af kraniofaciale sygdomme og kranio-maxillofacial regenerering i fremtiden på grund af den fremragende selvfornyelse evne og multi-afstamning differentiering potentiale. Derfor er det vigtigt at opnå mBMSCs i stort antal.
I denne undersøgelse blev knoglemarven skyllet ud af underkæben, og primære mBMSC’er blev isoleret gennem hele knoglemarvshængende dyrkning. Desuden blev CD29+CD90+CD45− mBMSCs renset gennem fluorescerende cellesortering. Anden generation af rensede mBMSC’er blev anvendt til yderligere undersøgelse og viste potentiale i at differentiere sig til osteoblaster, adipocytter og chondrocytter. Ved hjælp af denne in vitro-model kan man opnå et stort antal proliferative mBMSC’er, hvilket kan lette undersøgelsen af de biologiske egenskaber, den efterfølgende reaktion på mikromiljøet og andre anvendelser af mBMSC’er.
Introduction
Knoglemarvsmetrimyle stamceller (BMSC’er) er ikke-hæmatopoietiske stamceller fra knoglemarv , der manifesterer en stærk spredningskapacitet og differentieringspotentiale for flere afstamninger1,2,3,4. Faktisk er BMSC’er blevet betragtet som en ideel kandidat til knoglevævsteknik og regenerering, lige siden de blev opdaget. I årevis har iliaca kam eller lange knogler såsom skinnebenet og lårbenet været den mest almindelige kilde til BMSCs for kraniofacial regenerering. Eller af kommercielle BMSC’er, såsom mandibular BMSCs (mBMSCs), udviser dog visse forskelle fra BMSC’er med lange knogler, f.eks. Mandibler opstår fra neurale kamceller i neuroectoderm kimlaget og gennemgår intramembranøs ossifikation, mens aksiale og blindtarmssømmer er fra mesodermen og gennemgår endokondrisk ossifikation. Endvidere har kliniske observationer og eksperimentelle dyreforsøg konsekvent vist , at der er funktionelle forskelle mellem orofacial og iliaca crest BMSCs5,6,7,8. Rapporter har vist, at BMSCs stammer fra kraniofacial knogle såsom mandible, maxillary knogle, og alveolar knogle udstillet overlegen spredning, levetid, og differentiering kapacitet end dem fra aksial og blindtarmsfæld9. mBMSCs anses derfor for at være de foretrukne ressourcer til fremtidige terapeutiske anvendelser af kraniofaciale sygdomme som cherubisme, kæbetumor, osteoporose af kæbeknogle og paradentosevævsdefekt10,11,12. For at forstå behandlingspotentialet i prækliniske eksperimenter er det vigtigt at etablere en metode til hurtig isolering og dyrkning af mBMSCs in vitro.
I denne undersøgelse var målet at opnå rensede mBMSC’er ved hel knoglemarvstilkæv og flowcytometrisortering. Den anatomiske morfologi af rotte mandible, tydeligt observeret gennem mikrocomputertomografi (Micro-CT) og histologiske sektioner, viste, at mandiblens trabekulære knogle var mellem det incisor medullære rum og alveolarbenet. Knoglemarven fra trabekulær knogle blev skyllet for at opnå mandibular marv celler, men cellerne dyrket på denne måde var ikke ren mBMSCs og var tilbøjelige til at bestå af flere typer af celler med usikre potencies og forskellige afstamninger såsom celler fra knogler, fedt og endotelceller13,14. Det næste trin i cellerensning var særlig vigtigt. Flow cytometri filtrerer celler ved at genkende en kombination af celle-overflade proteiner og er blevet bredt vedtaget i berigelsen af mesenchymale stamceller. Celle homogenitet er den største fordel ved flowcytometry, men processen bestemmer ikke celle levedygtighed og kan resultere i en begrænset celleydelse. I denne undersøgelse blev P0 mBMSC’erne opnået ved overholdelse af hele knoglemarvsbesætning sorteret efter flowcytometry for at opnå mBMSC’er med høj renhed og stærk spredningskapacitet.
Denne undersøgelse introducerer en reproducerbar og pålidelig protokol for isolation, kultur og differentiering af rotte mandibular BMSCs ved hjælp af en kombination af hele knoglemarvsophæftning og flow cytometrisortering. Det er en pålidelig og bekvem metode for forskere inden for beslægtede områder at bruge.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til at isolere BMSC’er fra rotte mandibles in vitro ved at kombinere hele knoglemarvstilstrækkelse og fluorescerende cellesortering, hvilket er en enkel og pålidelig måde at opnå proliferative mBMSCs med stærk differentieringsevne. Denne metode kan foreløbigt rense mBMSCs ved flowcellesortering, men hvis der er højere krav til celle homogenitet, kan der være behov for mere præcise rensningsmetoder.
I øjeblikket er der fire hovedteknikker, der anvend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker for hjælp fra Laboratoriet for Digitaliseret Stomatologi og Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People’s Hospital. Værket i dette manuskript er støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, SHIPM-mu-fonden fra Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], Incitamentsprojektet for innovationsteam på højt niveau for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Og LJ er en forsker i Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai “Rising Stars of Medical Talent” Youth Development Program og “Chen Xing” projekt fra Shanghai Jiaotong University.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
