Summary

Трехмерное моторное нервное органоидное поколение

Published: September 24, 2020
doi:

Summary

Этот протокол обеспечивает всеобъемлющую процедуру для изготовления человека iPS клеток, полученных моторных нервных органоидов путем спонтанной сборки надежного пучка аксонов, вытянутых из сфероида в чипе культуры тканей.

Abstract

Фасцикл аксонов является одним из основных структурных мотивов, наблюдаемых в нервной системе. Нарушение аксон фасциклов может вызвать развитие и нейродегенеративных заболеваний. Хотя были проведены многочисленные исследования аксонов, наше понимание образования и дисфункции аксонов по-прежнему ограничено из-за отсутствия надежных трехмерных моделей in vitro. Здесь мы описываем пошаговый протокол для быстрого генерации органоида моторного нерва (MNO) из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPS) в микрофлюидной основе чипа культуры тканей. Во-первых, описано изготовление чипов, используемых для метода. Из клеток iPS человека образуется сфероид моторных нейронов (MNS). Далее дифференцированная MNS передается в чип. После этого аксоны спонтанно вырастают из сфероида и собираются в фасцикулу в микроканале, оборудованном чипом, который генерирует ткань MNO, несущую пучок аксонов, вытянутый из сфероида. Для анализа ниже по течению, MNOs могут быть взяты из чипа, которые будут установлены для морфологического анализа или вскрыты для биохимического анализа, а также кальция изображений и многоэ электродных записей массива. МНО, созданные с помощью этого протокола, могут способствовать тестированию и скринингу на наркотики и могут способствовать пониманию механизмов, лежащих в основе развития и заболеваний аксоновых фасциклов.

Introduction

Спинномозговые моторные нейроны (MN) расширяют аксоны на скелетные мышцы, чтобы контролировать движение тела. Их аксональные траектории хорошо организованы и регулируются в процессе развития. Несмотря на множество исследований по расширению аксона ируководство 1, механизмы для организованного образования аксон расслоения все еще находятся под следствием. Аксоны моторных нейронов часто повреждаются нейродегенеративными заболеваниями, такими как боковой амиотрофический склероз (ALS)2, но патофизиологические механизмы повреждения аксоновых фасциклов плохо изучены. Таким образом, физиологическая и патологическая модель для повторения образования и регрессии аксонового пучка требуется в полевых условиях.

Двигательный нейрон, полученный из стволовых клеток человека, является перспективной платформой для понимания развития и таких заболеваний, как ALS3. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (клетки iPS) могут быть использованы для моделирования заболеваний с использованием клеток, полученных пациентом. На сегодняшний день, различные методы дифференциации от плюрипотентных стволовых клеток вMN были зарегистрированы 4,5,6. Тем не менее, аксоны нейронов в двумерной культуре случайным образом ориентированы и не подыгрывляют микрооквидеону in vivo внутри развивающихся нервов, в которых аксоны однонаправленно собраны через плотные аксо-аксональныевзаимодействия 7. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали методику создания трехмерной ткани, напоминающей моторный нерв из клеток iPS 8 человека, иназвали тканьорганоидом моторного нерва (MNO). MNO состоит из клеточных тел, расположенных в сфероиде моторных нейронов (MNS) и аксонального фасцикула, вытянутого из сфероида. Аксоны в фасцикуле однонаправленно ориентированы, что напоминает аксоны в развитии моторных нервов. Таким образом, МНО однозначно обеспечивают физиологическую аксональное микрооквидение, которое не было сделано никакими другими ранее разработанными методами нейрональной культуры.

В этом протоколе мы описываем методы изготовления чипов культуры тканей, быстрой дифференциации моторных нейронов и формирования органоидов моторного нерва в разработанных чипах. Наш чип культуры тканей очень прост, и он содержит только отсек для принятия сфероида, микроканал для формирования аксонового пучка и отсек для корпусных аксоновых терминалов. Устройство не содержит сложных структур, включая микрогров или микропорные фильтры, которые часто используются для разделения аксонов и клеточных телпо размеру 9,10. Таким образом, наши устройства могут быть легко изготовлены, следуя шагам, описанным в этом протоколе, если доступна настройка фотолитографии.

Быстрая дифференциация клеток iPS человека достигается с помощью оптимизированного сочетания факторов индуцирования и узоров (SB431542, LDN-193189, ретинойной кислоты (РА) и сглаженной агонистки (SAG)) и факторов ускорения (SU5402 и DAPT). Сообщалось, что сочетание SU5402 и DAPT ускоряет дифференциацию периферических нейронов и нейронных клеток гребня11. В этом протоколе мы предлагаем три различных метода для создания MNOs, так что читатели могут принять решение о методе, наиболее подходящий для их потребностей. Мы рекомендуем проводить дифференциацию клеток iPS человека после формирования сфероида (3D-метода), так как дифференцированный MNS может быть передан непосредственно в чип культуры тканей. Кроме того, человеческие клетки iPS могут быть дифференцированы в моторные нейроны в монослойной (2D) культуры, а затем создан в трехмерных моторных нейронов сфероидов, как мы ранеесообщали 8. Мы обновили протокол, и с помощью трехмерного метода дифференциации, описанного в этом протоколе, можно избежать перехода с 2D на 3D и получить MNOs с более коротким временем дифференциации, меньшим количеством шагов и уменьшенными техническими рисками без этапа диссоциации. Коммерчески доступные нейроны могут быть также использованы для создания MNS, чтобы уменьшить время для дифференциации.

Для создания MNO мы обуучили MNS в чипе культуры тканей. Аксоны удлиняются от сфероида и простираются в микроканал, в котором топоры собираются и выравниваются однонаправленно. Это облегчает аксо-аксональное взаимодействие и спонтанное образование плотно собранной однонаправленной ткани пучка аксонов в микроканале, что однозначно достигается этим протоколом, в то время как либо спонтанное образование пучка, либо управляемая аксональная ориентация в одиночку могут бытьдостигнуты другими протоколами 12,13,14. В типичном эксперименте, немногие клетки мигрируют из сфероидов в микроканал, и большинство клеток остаются рядом сфероидов. Этот метод позволяет спонтанно отделять аксоны от сфероидов без использования зависящих от размера физических барьеров (например, микрогров или микропорных фильтров) для отделять аксоны от клеточных тел.

В результате MNO может быть подвергнут различным обследованиям, включая морфологический, биохимический и физический анализ. Клеточное тело и расширенный аксоновый пучок могут быть физически изолированы путем резки и могут быть отдельно проанализированы для экспериментов ниже по течению, например, биохимических анализов. Биологические материалы, включая РНК и белок, могут быть выделены из нескольких аксоновых пучков для регулярных биохимических анализов, включая RT-PCR и западный blotting. Здесь мы описываем протокол для генерации органоидов моторного нерва из клеток iPS, который предлагает привлекательную физиологическую и патологическую модель для изучения механизма, лежащего в основе развития и заболевания аксоновых фасциклов.

Protocol

1. Изготовление плесени СУ-8 по фотолитографии ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура включает в себя опасные химические вещества. Используйте дым капот и СИЗ во всем. Очистите кремниевую пластину (диаметром 4 дюйма, толщиной 1 мм, полированной) ацетоном и удар азотным газом. Затем выпекать при температуре 180 градусов по Цельсию в течение 3 минут, чтобы высохнуть. Выдать 3 мл СУ-8 2100 на очищенную пластину. Пальто SU-8 равномерно на пластине с помощью спинового пальто при 500 об/мин на 10 с, а затем, последовательно спина на 1500 об /мин для 30 с с ускорением 300 об / мин/ с, чтобы получить 150 мкм толщиной слой СУ-8.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кремниевая пластина расположена в центре спинового вешалки и правильно закреплена вакуумом. Мягкая выпечка на горячей тарелке при температуре 50 градусов по Цельсию в течение 10 минут, при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 7 минут, и при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 45 минут. Установите фотомаск(рисунок 1) на выравниватель маски и подвергайте ультрафиолетовому свету (365 нм) на 60 с.ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции должно быть оптимизировано соответствующей дозой ультрафиолетового света. После воздействия, выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 6 минут, и при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 13 минут на горячей тарелке. Разработать пластину в течение 10-20 мин у разработчика СУ-8 с агитацией с помощью орбитального шейкера, изменив развивающийся раствор один раз в процессе.ПРИМЕЧАНИЕ: Продлить время разработки, когда обломки Су-8 остаются. Промыть в изопропанол и аккуратно высушить с азотным газом. Измерьте высоту отложенного СУ-8 с помощью измерительного микроскопа и убедитесь, что его толщиной около 150 мкм. Он может храниться бесконечно при комнатной температуре. 2. PDMS микрофлюидной основе ткани культуры чип изготовления Зафиксировать вафельку SU-8 в контейнер (например, 15 см пластиковой чашки Петри) двойной боковой лентой. Удар пыли с пластины с помощью азотного газа. Для силанизации поместите су-8-отложенную пластину в вакуумную камеру вместе с небольшим контейнером (например, 35 мм тарелки). Капля 10 МКЛ (тридекафлюоро-1,1,2,2-тетрагидрооктил)-1-трихлоросилейн в небольшой контейнер. Не применять непосредственно (tridecafluoro-1,1,2,2-тетрагидрооктил)-1-трихлоросилейн к Вафельне СУ-8. Закройте вакуумную камеру плотно и включите вакуумный насос, по крайней мере 2 ч. Возьмите пластиковый стаканчик и налейте силиконовый еластомер (например, Silpot 184 или эквивалентно Sylgard 184) и лечебный агент при соотношении веса 10:1. Затем хорошо перемешайте с помощью шпателя и дега в вакуумной камере до тех пор, пока пузырьки не будут полностью удалены. Налейте смесь PDMS в контейнер с пластиной СУ-8 до нужной толщины (3-4 мм) и снова дегазации для удаления пузырьков. Выпекать PDMS в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию, по крайней мере 3 ч, чтобы полностью вылечить PDMS. После охлаждения, отрезать вылечить PDMS от пластины с помощью скальпеля или лезвия бритвы. Чтобы создать две камеры чипа культуры тканей, пробить два отверстия, где два отсека расположены с помощью 1,5 мм диаметр биопсии удар. Чтобы создать средний резервуар, приготовьте еще одну смесь PDMS (силиконовый еластомер и лечебный агент при соотношении веса 10:1) и вылейте его в новую 10-сантиметровую чашку Петри. Отрегулируйте объем заливки до 5 мм толщины PDMS. Выпекать PDMS в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию, по крайней мере 3 ч, чтобы полностью вылечить PDMS. После охлаждения PDMS, отрезать вылечить PDMS скальпелем, чтобы получить прямоугольное кольцо. Склеить нижний слой со средним резервуаром, применяя между ними несыхаченные PDMS и выпекая собранные слои PDMS. Эта связанная структура приводит к чипу культуры ткани PDMS. Очистите чип культуры ткани PDMS скотчем, чтобы удалить пыль и мелкие частицы с поверхности. Чипы культуры ткани PDMS могут храниться при комнатной температуре, если защищены от пыли и УФ. 3. Подготовка культуры Культура средыПРИМЕЧАНИЕ: Все средства массовой информации, перечисленные ниже, должны быть отфильтрованы для стерилизации, если не указано иное. Подготовленные средства массовой информации могут храниться при 4 градусах Цельсия и использоваться в течение месяца. Для приготовления среды mTeSR Plus: смешайте одну бутылку 100 мл mTeSR Plus 5x с одной бутылкой 400 мл mTeSR Plus Basal Medium. Для приготовления 100 мл среды KSR: в 85 мл DMEM/F12 добавьте 15 мл замены сыворотки Knockout (KSR, 15%), 1 мл коммерческих добавок глутамина (1%) и 1 мл несущественных аминокислот (NEAA, 1%). Для подготовки 100 мл N2 среды: В 100 мл нейробазальной среды, добавить 1 мл N2 (100x), 1 мл коммерческих глутамин дополнения, и 1 мл NEAA. Для подготовки 250 мл среды созревания: в 250 мл нейробазальной среды добавьте 5 мл B27 (2%), 2,5 мл коммерческих добавок глутамина (1%) и 2,5 мл пенициллина/стрептомицина (1%). Повторное соединение (ретинойная кислота (РА), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) в клеточном культуре класса DMSO до нужной концентрации. Подготовьте алициты и храните их при -20 градусах по Цельсию на срок до 6 месяцев. Используются следующие фондовые растворы: 1 мМ РА, 10 мММ SB431542, 100 МКМ ЛДН-193189, 10 мМ СУ5402, 10 мМ ДАПТ, 1 мМ САГ, 10 мМ Y-27632. покрытиеПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить полимеризацию мембранной матрицы подвала теплом, избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттепели. Если это возможно, обработать все процедуры покрытия предварительно охлажденными наконечниками пипеток и трубками. Матрица мембраны подвала должна быть разморожена на ночь при 4 градусов по Цельсию и aliquoted с помощью предварительно охлажденных пипеток советы и трубки. Алициты могут быть заморожены при -20 градусов по Цельсию или -80 градусов по Цельсию. Оттепель замороженных aliquot при 4 градусов по Цельсию на льду. Алицит следует держать холодным во время процедуры покрытия. Используя предварительно охлажденный наконечник пипетки, разбавьте мембранную матрицу подвала ледяным DMEM/F12 в соотношении 1:40. Неиспользованная разбавленная мембранная матрица подвала может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 2-3 дней, учитывая, что полимеризации не произошло. Добавьте 1 мл мембранной матрицы подвала/раствор DMEM-F12, чтобы покрыть один колодец из 6 хорошо пластины. Инкубировать пластину при комнатной температуре, по крайней мере час, или 4 градусов по Цельсию на ночь. Пластины с покрытием могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение максимум одной недели. 4. Обслуживание ячеек iPS ПРИМЕЧАНИЕ: Недифференцированные iPS-клетки поддерживаются в среде mTeSR Plus и суб-культурны, когда слияние ≥ 90% наблюдается в 6 хорошо пластины в этом протоколе. Небольшие корректировки могут потребоваться для ячеек iPS, культурных в других средствах массовой информации. Подготовка подвал мембраны матрицы покрытием блюда, как упоминалось ранее в шаге 3.2. Полностью аспирировать средство mTeSR Plus. Вымойте колодец один раз с PBS и добавить 0,5 мл минрайвого реагента (см. Таблицу материалов). Подождите несколько секунд и аспирировать решение. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе в течение 5 минут или до тех пор, пока клетки становятся круглыми.ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться между различными линиями клеток iPS и слиянием. Пожалуйста, периодически проверяйте под микроскопом, чтобы определить время диссоциации во время инкубации. Добавьте 1 мл среды mTeSR Plus и коснитесь пластины на 30-60 с, чтобы отсоединить колонии. Аккуратно смешайте 1 мл раствора клеточной подвески с 7 мл свежего mTeSR плюс средний. Не пипетки более 5 раз. Плита в соотношении 1:8. Обычно добавляем 1 мл суспензии из шага 4.5 и добавляем 1 мл mTeSR плюс средства массовой информации, дополненные 5-10 МКМ Y-27632 (ингибитор ROCK). Коэффициент разбавления прохода зависит от линии iPSC. Поместите ячейку в инкубатор CO2/37 с 5%. На следующий день удалите Y-27632, добавив свежий mTeSR Plus среднего. После этого, изменить средства массовой информации через день на начальном этапе, и каждый день, как клетка достигает более высокого слияния. 5. Дифференциация клеток iPS на моторные нейроны ПРИМЕЧАНИЕ: Все варианты ниже (5,2, 5,3 и 5,4) производят MNOs с эффективностью 90%. Пропуск iPSC для дифференциации моторных нейроновПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация может быть успешно проведена в 3D (5.2) или 2D (5.3) протоколах. Разрешить недифференцированных iPS-клеток расти, пока не достигнет слияния около 80% в mTeSR Plus среды в 6 хорошо пластины. Полностью аспирировать среду. Немедленно промойте колодец один раз стерильным PBS и добавьте 0,5 мл раствора диссоциации клеток в клетки. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе в течение примерно 2-3 мин, или до тех пор, пока клетки становятся разделенными и круглыми, но остаются прикрепленными к колодецу. Добавить 1 мл среднего и осторожно пипетки вверх и вниз несколько раз с помощью 5 мл серологического пипетки. Перенесите подвесную клетку на 15 мл трубки, состоящей из 4 мл среды. Центрифуга при 200 x g в течение 3 мин. Тщательно аспирировать супернатант, оставляя гранулы нетронутыми, и повторного незаменимия клеток в 1 мл среды дополняется 10 МКМ Y-27632. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и перейти к 5,2 (3D дифференциации), или 5,3 (2D дифференциации). Формирование сфероида моторных нейронов (MNS) в 3D дифференциации (3D-протокол)ПРИМЕЧАНИЕ: Полное среднее изменение осуществляется ежедневно с Дней 0-12 дифференциации(рисунок 2). Семя iPS-клеток от шага 5.1.7 до 96 хорошо U нижней пластины на 40000 клеток / хорошо в 100 йл mTeSR Plus дополнен 10 МКМ Y-27632. На следующий день замените каждый колодец 100 мл свежей среды. В дни 0 и 1: Аспирировать культурную среду и заменить 100 л среды KSR (3.1.2) дополнено 10 МКМ SB431542 и 100 nM LDN-193189. В дни 2 и 3: Аспирировать культурную среду и заменить 100 МКЛ среды KSR дополнены 10 МКМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 5 МКМ DAPT, 5 МКМ SU5402, 1 МКР РА и 1 МКМ SAG. В дни 4 и 5: Подготовье смешанной среды, состоящей из 75% среднего KSR и 25% N2 среднего (3.1.3). Затем, аспирировать культурную среду и заменить 100 МКЛ смешанной среды, дополненной 10 МКМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 5 МКМ DAPT, 5 м SU5402, 1 МКМ РА, и 1 МКГ SAG. В дни 6 и 7: Подготовье смешанной среды, состоящей из 50% KSR среднего и 50% N2 среды. Затем, аспирировать культуру среды и заменить его на 100 МКЛ смешанной среды дополняется 5 МКМ DAPT, 5 МКМ SU5402, 1 МКМ ретинойной кислоты и 1 МКМ SAG. В дни 8 и 9: Подготовье смешанной среды, состоящей из 25% KSR среднего и 75% N2 среды. Затем аспирировать культурную среду и заменить 100 МКЛ смешанной среды, дополненной 5 МКМ ДАПТ, 5 МКМ СУ5402, 1 МКМ РА и 1 МКМ SAG. В дни 10 и 11: Замените среду на 100 мкл среды N2, дополненную 5 МКМ ДАПТ, 5 МКМ СУ5402, 1 МКР РА и 1 МКМ САГ. На 12-й день: Приступить к передаче MNs в чип культуры тканей (Шаг 6) или заменить средний с 100 МЛ среды созревания (3,1,4) дополняется 20 нг / мл мозга нейротрофический фактор (BDNF).ПРИМЕЧАНИЕ: MNS может быть передан чип культуры тканей, начиная с 12-го дня до 19-го дня. Сфероиды, которые не передаются должны быть сохранены культурные в 96 хорошо U нижних пластин в среде созревания дополняется 20 нг/мл BDNF до передачи. (Альтернативный вариант) 2D дифференциация и переход на 3D MNS (“2D-протокол”) Аспирировать раствор покрытия из предварительно покрытой пластины 12 хорошо. Семя iPS-клеток из шага 5.1.7 при плотности 100 000 – 200 000 ячеек на колодец в среде mTeSR Plus с 10 МКМ Y-27632.ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте культивирование недифференцированных клеток iPS в среде mTeSR Plus без Y-27632 до тех пор, пока клетки не достигнут 80% слияния, если клетки слишком редки для следующего шага (5.3.3). В дни 0 и 1: Аспират культуры среды и заменить 1 мл среды KSR (3.1.2) дополнен 10 МКГ SB431542 и 100 nM LDN-193189. В дни 2 и 3: Аспират культуры среды и заменить его на 1 мл ksR среды дополнены 10 МКМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 5 МКМ DAPT, 5 МКМ SU5402, 1 МКР РА и 1 МКГ. В дни 4 и 5: Подготовье смешанной среды, состоящей из 75% среднего KSR и 25% N2 среднего (3.1.3). Аспират культуры среды и заменить 1 мл смешанной среды дополняется 10 МКМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 5 МКМ DAPT, 5 МКМ SU5402, 1 МКМ РА, и 1 МКМ SAG. В дни 6 и 7: Подготовье смешанной среды, состоящей из 50% KSR среднего и 50% N2 среды. Аспирировать культурную среду и заменить ее 1 мл смешанной среды, дополненной 5 МКМ ДАПТ, 5 МКМ SU5402, 1 МКМ ретинойной кислоты и 1 МКМ SAG. В дни 8 и 9: Подготовье смешанной среды, состоящей из 25% KSR среднего и 75% N2 среды. Аспирировать культурную среду и заменить 1 мл смешанной среды, дополненной 5 МКМ ДАПТ, 5 МКМ SU5402, 1 МКР и 1 МКГ SAG. В дни 10 и 11: Замените среду 1 мл среды N2, дополненной 5 МКМ ДАПТ, 5 МКМ SU5402, 1 МКМ РА и 1 МКМ SAG. На день 12: Аспирировать дифференциации среды, быстро хорошо мыть один раз с PBS и добавить 0,5 мл среды отслоения клеток. Поместите тарелку в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1-3 мин (например, при использовании TrypLE Express) или 20-30 мин (например, при использовании Accutase). Используя пипетку P1000, аккуратно соберите клетки и перенесите клетки в коническую трубку 15 мл со свежей средой созревания и центрифугой при 200 x g в течение 3 мин. Если клетки неуклюжие, аккуратно пипетки вверх и вниз несколько раз. Не пипетки слишком много, как это может привести к повреждению клеток. Аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в 1 мл среды созревания (3.1.4) дополняется 20 нг/мл BDNF. Подсчитайте ячейку с помощью гемоцитометра. Плита клеток на 10000-40000 клеток на колодец в 96 хорошо U нижней пластины в среде созревания дополняется 20 нг / мл BDNF. Первоначальная плотность посева должна быть оптимизирована в зависимости от линии клеток iPS и состояния клеток, так что диаметр сфероида составляет 800-900 мкм при введения в чип культуры тканей. В большинстве случаев, начать с 20000 клеток на колодец на начальном этапе, а затем увеличить или уменьшить количество клеток в зависимости от размера. Культура в течение дополнительных 3-10 дней, пока клетки образуют сфероид с гладким краем. (Альтернативный вариант): образование MNS из моторных нейроновПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные человеческие нейроны, полученные из клеток iPS (см. таблицу материалов),могут быть использованы для генерации MNOs вместо дифференциации от клеток iPS человека. После оттаивания криовиальных моторных нейронов, быстро повторное течение клетки с 9 мл моторных нейронов среды. Спин вниз на 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и повторно гранулы с моторной нейронной среды. Следуйте тем же шагам, что и выше (5.3.12- 5.3.13), чтобы произвести MNS. 6. Подготовка чипа культуры тканей для формирования органоидов моторного нерва (MNO) Стерилизовать подготовленный PDMS (от шага 2.13) путем погружения его в 70% этанола в чашке Петри, по крайней мере 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги должны быть манипулировать в кабинете биобезопасности. Стерилизовать микроскоп стекла (76 х 52 мм), погружая его в 70% этанола в чашке Петри. Во время процесса сушки микроскопа стекла, поместите устройство PDMS на половину мокрого микроскопа стекла и дайте ему высохнуть полностью, ожидая на ночь. После того, как он полностью высушен, устройство PDMS должно придерживаться стекла.ПРИМЕЧАНИЕ: Это склеивание не является постоянным, чтобы отсоединить устройства PDMS от микроскопа стекла после культуры для сбора тканей. Постоянная связь кислородной плазмы может быть использована для максимального столкновения между PDMS и стеклом, но это будет запрещать разборку чипов и сбора тканей. Пальто поверхности микроканала в устройстве PDMS и микроскоп стекла с 30 йл разбавленной мембранной матрицы подвала в DMEM/F12 (1:40) путем внесения капли на одной стороне входе канала, а затем аспирировать раствор с другой стороны входе с пипеткой или всасывающий насос (Рисунок 3A). Не аспирировать слишком большой объем раствора, чтобы избежать загрязнения пузыря. Затем инкубировать устройство PDMS в течение 1 часа при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию во вторичном контейнере (например, чашка Петри). 7. Формирование органоидов моторного нерва (MNO) Замените раствор покрытия предварительно разогретой 150 МКЛ среды созревания, дополненной 20 нг/мл BDNF незадолго до использования. Затем поместите MNS из шага 5.2.9 или 5.3.13 в вход микроканал с помощью микропипета с широкой наконечником скважины. MNS может спонтанно осесть на дне устройства под действием силы тяжести. Не применять слишком большое давление при введении MNS (Рисунок 3B).ПРИМЕЧАНИЕ: Если MNS застрял на боковине отверстия в чипе культуры тканей, аккуратно аспирировать раствор с другой стороны входе. Заполните небольшой резервуар (например, колпачок 15 мл трубки) стерильной водой и поместите его рядом с чипом культуры тканей во вторичном контейнере для предотвращения среднего испарения. Затем поместите его в инкубатор CO2 /37С. Для среднего изменения, аспирировать исчерпаны среды культуры из центра среднего водохранилища (рисунок 3C). Не аспирировать все среды и ткани. Аккуратно добавьте свежую среду созревания (с BDNF). Средство должно меняться каждые 2-3 дня. Не сушите культурную среду в любое время во время культуры. Аксоны вырастают из MNS в канал и спонтанно собираются в один пучок за 2-3 недели, что приводит к образованию MNO. MNO можно обучить более 1 месяца в устройстве. 8. Вниз по течению анализ MNO Иммуностимуляторы с цельной установкой Принесите устройство или посуду в химический дым капот. Исправить MNO, добавив примерно равный объем 8% параформальдегид (PFA) в средствах массовой информации для достижения окончательной концентрации 4% PFA. Очистите устройство PDMS от стекла и инкубировать в течение 15-20 минут при комнатной температуре. Вымойте MNO с PBS, а затем повторить PBS стиральная 2x. Permeabilize MNO с 0,2% от Triton X-100 в PBS и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Вымойте MNO с PBS, а затем повторить PBS стиральная 2x. Затем заблокировать MNO с PBS, содержащий 1% BSA и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Разбавить первичные антитела в PBS, содержащие 0,1% BSA и инкубировать MNO с первичным раствором антитела на ночь при 4 градусов по Цельсию. Вымойте MNO с PBS три раза. Разбавить вторичные антитела в PBS с 0,1% BSA и инкубировать MNO со вторичным раствором антител для 2 ч при комнатной температуре. Затем мыть MNO три раза с PBS. Пятно MNO с Hoechst в PBS, содержащий 0,2% Тритон-X и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. Вымойте MNO три раза с PBS. Иммунооблибровый MNO готов к визуализации с помощью флуоресцентных или конфокальных лазерных микроскопов. Сбор тканей и изоляция аксонового пучка Налейте 10 мл раствора HBSS в чашку Петри длиной 10 см. Затем погрузите все устройство PDMS в решение HBSS. Аккуратно отсоедините PDMS от микроскопического стекла под стереомикроскопом. Когда ткани прилипают к устройству PDMS, аккуратно нанесите 1 мл раствора HBSS из верхней части отверстия с помощью пипетки. После того, как ткань отрывается от PDMS, аккуратно нанесите 1 мл HBSS на микроскоп стекла, чтобы полностью отделить PDMS от микроскопа стекла. Чтобы изолировать аксоновую связку от сфероида, вырежьте аксоновую связку хирургическим ножом или пинцетом под микроскопом. Отрежьте пучок аксона немного далеко (1 мм) от сфероида, чтобы избежать загрязнения мигрирующих клеток. Изолированные пучки аксона и сфероиды могут быть дополнительно проанализированы различными анализами ниже по течению, такими как RT-PCR, РНК-сек и западный blotting. Чип культуры PDMS может быть использован повторно. Для очистки культуры чип, sonicate культуры чип в дистиллированной воде в течение 15 минут. Затем sonicate чип в дистиллированной воде дополняется 1% моющего средства. Вымойте культуру чип с дистиллированной водой 5 раз. Изображение кальцияПРИМЕЧАНИЕ: Нейронная активность может быть измерена с помощью индикатора кальция как до, так и после сбора тканей из чипа культуры тканей (от 8,2). Протокол основан на определенном коммерческом комплекте (см. таблицу материалов). Кроме того, могут быть использованы другие наборы изображений кальция или эквивалентные методы. Вымойте MNO с PBS (без Ca2 “и Mg2″в течение трех раз. Инкубировать ткани с 5 МКМ Флуо-4АМ в записи среды (20 мМ HEPES, 115 мМм NaCl, 5,4 мМ ККл, 0,8 мм MgCl2, 1,8 мММ, CaCl2, 13,8 мМ глюкозы) для 30-60 мин при 37 градусов по Цельсию. Добавление 0,01-0,02% Pluronic F-127 может помочь поглощению Fluo-4 AM в клетки. Затем промойте ткань с помощью PBS (без Ca2 и Mg2)и замените ее записывающей средой. Приобретайте изображения замедленного действия с помощью флуоресцентной микроскопии с набором фильтров GFP/Cy2. Установите время экспозиции менее 20 мс на кадр. Откройте приобретенный файл фильма в качестве последовательности изображений с помощью Изображения J. При использовании цветных CCD или CMOS камеры, конвертировать RGB изображения в 16-битные моно изображения. Открыть “Анализ | Инструменты | ROI Manager”, Нарисуйте область интереса и нажмите кнопку”Добавить”. Нажмите “Multi Measure”. Среднее интенсивность в нескольких рентабельность инвестиций будет показано в результате. Участок изменения интенсивности сигнала с помощью общего программного обеспечения анализа данных. Измерение нейронной активности с помощью массива Multi-electrodeПРИМЕЧАНИЕ: Активность моторных нейронов может быть захвачена мульти-электродный массив (MEA). После создания MNO, передать его на мембрану подвала матрицы покрытием MEA зонд. Распоить ткань на электродах. Добавьте 200 МКЛ среды созревания и инкубировать 1-2 ч при 37 градусов по Цельсию, чтобы позволить MNO прикрепиться к поверхности. Замените носитель на записывающую среду (8.3.2). Дополнительно поместите сетку и вес поверх MNO, чтобы увеличить контракт с электродами. Установите зонд MEA на сцену головы записи. Протрите контакт между зондом MEA и головной стадией с 70% этанола. Начните записывать нейронную активность, следуя инструкциям производителей MEA.

Representative Results

Моторные нейроны были дифференцированы в течение 12-14 дней в процедурах 3D дифференциации(рисунок 4 и рисунок 5). Важно отметить, что более 60% клеток выразили двигательный нейронный маркер HB9 во время дифференциации. Иммуногистохимия показала, что около 80% клеток в MNS были SMI32-положительных моторных нейронов. HB9 и SMI32 являются установленными маркерами моторных нейронов на раннейстадии 15,16. Выражение HB9 и SMI32 являются ключевыми параметрами, которые должны быть подтверждены для обеспечения клеточной идентичности моторных нейронов. После введения MNS в чип культуры, аксоны распространяются на канал и аксон формы пучка. Благодаря микроканалам, выступающей в качестве физических направляющих, аксоны удлиняются от MNS и образуют пучок аксо-аксонального взаимодействия(рисунок 6A). Важно подтвердить образование аксонового пучка микроскопическим наблюдением, чтобы подтвердить генерацию MNO. Успешный MNO несет аксон расслоение шире, чем 50 мкм и несколько изолированных аксонов из пучка в канале. Первоначальное удлинение аксонов можно наблюдать через 24 часа после введения сфероида. В течение следующих 3-4 дней аксоны достигли центра микроканал, а затем достигает другого конца в течение дополнительных 10 дней(рисунок 6A). Следовательно, аксоны собрались и сформировали прямой и однонаправленный пучок в 2-3 недели в чипе, и нейрональной деятельности наблюдались после этого. Органоиды моторного нерва могут быть собраны из чипа путем отсоединения PDMS из микроскопического стекла для биологического анализа(рисунок 6B). Аксон расслоения и тела клеток могут быть вскрыты и изолированы путем резки с помощью хирургического ножа или пинцета подмикроскопом (рисунок 6B). Эти биологические материалы, включая РНК и белок, могут быть использованы для регулярных биохимических анализов, таких как RT-PCR и западные blotting. В аксоновых пучках МНО, ядерных или дендритных белков производителя не обнаруживаются в западных blotting(рисунок 6C). В сочетании с индикатором кальция (Fluo-4 AM) нейронная активность может быть захвачена в чипе культуры тканей. Спонтанная активность моторных нейронов в сфероиде и аксоновом пучоке наблюдалась в пределах MNO. Кроме того, нейронная активность наблюдалась с помощью многотемоделной системы массива. Рисунок 1: Измерение чипа культуры ткани PDMS.(A)Фотомаска чипа культуры тканей. (B)Размеры микроканал в чипе культуры тканей. Диаметр базовой камеры для хозяйки моторного нейрона сфероида составляет 2 мм, а отверстие PDMS над камерой составляет 1,5 мм. Ширина и высота микроканального канала, преодолевая две камеры, находятся на высоте 150 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Схематическая иллюстрация моторной дифференциации нейронов.(A)Этапы дифференциации связаны с нервной индукцией, узором в линию моторных нейронов и созреванием моторных нейронов. (B)Два варианта создания моторного нейрона сфероида (MNS) из iPS-клеток: 3D-протокол и 2D-протокол с диссоциациацией двигательных нейронов. Моторный нервный органоид (MNO) может быть получен по обоим протоколам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Шаг за шагом протокол для покрытия мембранной мембраны подвала и введения сфероидов моторных нейронов.(A)Покрытие мембранной матрицы подвала в канале чипа культуры ткани. (B)введение MNS в отверстие чипа. (C)Культура среднего изменения стремлением исчерпаны среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: 2D и 3D дифференциация моторных нейронов.(A)Курс времени репрезентативной дифференциации 3D MNS (3D-протокол). Размер МНБ постепенно увеличивался с течением времени. Шкала бар: 500 мкм. (B) Курс времени 2D дифференциации на -D2, D0, D1, D6, D12 (2D протокол). Шкала бар: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Характеристика моторных нейронов.(A) (Слева) криозиция MNS окрашенных SMI-32 антитела и DAPI. (Средний) Фазово-контрастное изображение replated MNS на поверхности мембраны подвала матрицы-покрыть. Наблюдалось аксональное удлинение. (справа) Аксоны replated MNS запятнанные с антителами Synapsin iего и Tuj1. Шкала бар: 500 мкм (слева и средним) и 50 мкм (справа). (B)репрезентативное изображение 2D моторных нейронов, иммунолимуловых антителами Tuj и HB9. Шкала бар: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Характеристика органоида моторного нерва (MNO), генерируемого в чипе культуры.(A)Репрезентативные изображения удлинения аксона и толстого образования аксонового пучка на D32. Шкала бар: 500 мкм. (B)Иммуностимулирование органоидов моторного нерва (MNO) SMI-32 и DAPI. Аксоны и клеточные тела могут быть изолированы путем физической резки. Шкала бар: 1 мм. (C) Чистота белка из аксонов и клеточных тел количественно западной blotting. MAP2, дендритный маркер, не был обнаружен в аксональный белок, в то время как аксональный маркер Tau1 обогащен аксональным белком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Этот протокол описывает образование органоида моторного нерва (MNO), который имеет аксон расслоение, вытянутое из сфероида моторных нейронов, генерируемых из клеток iPS человека. Сформированный аксоновый пучок толстый, гибкий и хорошо организованный в однонаправленных структурах. Путем вскрытия аксонового пучка, высокой чистоты аксонового белка и РНК можно получить достаточно для биохимического анализа. Нейронная активность может быть измерена в аксоновых пучках и сфероидах с помощью изображений кальция. Загрязнение ядерных и дендритных белков в аксональный лисат не было обнаружено западным blotting, демонстрируя, что наш метод эффективно отделил аксоны от клеточных тел и дендритов.

Одним из преимуществ этого протокола является быстрая дифференциация и генерация MNO, оснащенного аксоновой связкой, в которой все процессы можно сделать за 4 недели с помощью 3D-протокола и 5-6 недель с использованием 2D-протокола. Это короткий по сравнению с другими протоколами, которые обычно принимают 3-4 недель, чтобы просто дифференцировать в MN от эмбриональных стволовых клеток иiPS-клеток 17, и это занимает дополнительные 2-4 недели, чтобы получить аксональной удлинения. 3D-протокол, как правило, предпочтительнее 2D-протокола из-за более короткого времени дифференциации, меньшего количества шагов и снижения технических рисков без этапа диссоциации по сравнению с 2D-протоколом. Микрофлюидные ткани культуры чип был разработан таким образом, что аксоны MNS может удлиниться к другому отсеку через микроканал, который облегчает формирование пучка аксонов, вызывая аксо-аксональные взаимодействия и близость между аксонами. Из-за простой экспериментальной настройки, все описанные здесь протоколы могут быть выполнены не только биоинженерами, которые знакомы с манипуляцией чипом культуры тканей, но и биологами и нейробиологами, которые не знакомы с методами микрофлюиды и микрофабрики. Следует отметить, что шаги 1 и 2 также могут быть выполнены с помощью внешнего сервиса изготовления.

Одним из важнейших шагов для достижения протокола является последовательное изменение среды культуры. Рекомендуется полностью менять культурную среду на каждом шагу во время дифференциации, чтобы факторы в оттраченной среде не мешали дифференциации МН. Другим критическим моментом этого протокола является поддержание недифференцированных ячеек iPS в хорошем качестве. Качество начальной культуры клеток iPS значительно влияет на эффективность получения моторных нейронов и MNO. Другое дело, что диаметр МНБ должен быть меньше размера отверстия чипа (1,5 мм). Большие сфероиды не могут войти в камеру, и потенциально испытывают тяжелый гипоксический некроз в центральной части. Размер MNS можно контролировать путем изменения первоначального числа посева клеток iPS (в 3D-протоколе) или моторных нейронов (в 2D-протоколе). Плотность посева ячеек должна быть оптимизирована для каждой линии ячеек iPS.

Разрозненные микрофлюидные устройства с микрогров и небольшими порными фильтрами широко используются для отделения аксонов от клеточных тел и дендритов. Этот метод может также отделить аксоны от клеточных тел и дендрита, с превосходным обилием аксонов в комплекте тканей. По сравнению с другими методами, одним из основных ограничений этого метода является то, что он не может отделить два различных культурных средства массовой информации в текущем дизайне чипа культуры тканей, что препятствует возможности совместной культуры двух разных клеток, которые требуют двух различных средств массовой информации. Другим ограничением является то, что чип PDMS положить предопределенное ограничение на размер ткани. Сфероид размером с отверстие не может войти в камеру, а аксоновский пучок не может расти толще, чем ширина микрофлюидного канала.

Этот метод может быть применен к другим типам нейронов. Наша группа показала способность моделировать мозговой тракт с помощью модифицированного метода в сочетании с церебральными органоидными методами18. Кортикальные сфероиды были введены в обоих отсеках и аксонов спонтанно удлиненные взаимно к каждому сфероиду, а затем аксон расслоение формируется спонтанно. В результате, два корковых сфероида могут быть соединены через аксон расслоение, и ткань может быть получена как один кусок. Это свидетельствует о том, что подход является весьма универсальным для формирования ткани аксон расслоения независимо от типов нейрональных клеток. В этом протоколе, человеческие клетки iPS были использованы, однако, другие стволовые клетки включая людские клетки ES и людские нервные стволовые клетки могут быть использованы с изменениями к представленного протокола. 3D сфероиды нейронов могут быть сгенерированы различными протоколами19,20. Этот метод изготовления тканей с аксоновым пучком потенциально может быть объединен в будущем с другими протоколами дифференциации для создания сфероида 3D MN. Кроме того, толщину и длину аксонового пучка можно контролировать, просто изменив ширину и высоту микроканалов чипа культуры тканей для будущих разработок.

Мы считаем, что этот протокол может быть использован для тестирования и скрининга на наркотики и может способствовать пониманию механизмов, лежащих в основе развития и заболеваний аксоновых фасциклов.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Японское общество содействия науке (JSPS) Гранты в помощь научным исследованиям 17H05661 и 18K19903, Core-2-основной программы, и за пределами института ИИ.

Materials

(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane Sigma 440302
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710
200µl Wide Bore Pipet Tips BMBio BMT-200WRS
6-well plates Violamo 2-8588-01
Accutase ICT AT104
B-27 Supplement (50X) Gibco 17504044
Bovine serum albumin Sigma A6003
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Wako 020-12913
CO2 incubator Panasonic MCO-18AIC
Cryostor CS10 Stem Cell Technologies 07959
DAPT Sigma D5942
DMEM/F12 Sigma D8437
Fluo-4 AM Dojindo Laboratories CS22
GlutaMAX Supplement Gibco 35050-061
Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) Corning 354230
HB9 Antibody Santa Cruz sc-22542
HBSS Wako 085-09355
Hoechst 33342 Sigma 14533
iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) Cellular Dynamics R1051
Isopropyl alcohol (IPA) Wako 166-04836
Knock Out Serum Replacement Gibco 10828028
LDN193189 Sigma SML0559
MEA probe Alpha MED Scientific inc MED-P5004A
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) Sigma M7145
Microscope Glass Matsunami S9111
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 05825
N2 supplement Wako 141-08941
Neurobasal medium Gibco 21103049
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Photoresist SU-8 2100 Microchem #SU-8 2100
Prime surface 96U Sumitomo Bakelite MS-9096U
ReLeSR (passaging reagent) Stem Cell Technologies 05872
Retinoic acid Wako 186-01114
SAG Sigma SML1314
SB431542 Wako 192-16541
Silicon wafer SUMCO PW-100-100
Silpot 184 w/c kit Dow Toray Silpot 184 w/c kit
Smi32 Antibody Biolegend 801701
SU5402 Sigma SML0443
SU-8 Developer Microchem Y020100
Synapsin I Antibody Millipore Ab1543
TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) Gibco 12604-021
Tuj1 Antibody Biolegend 801202
Y-27632 Wako 030-24021

References

  1. Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).
  2. Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
  3. Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
  4. Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
  5. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
  6. Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
  7. Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
  8. Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
  9. Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421 (2018).
  10. Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250 (2019).
  11. Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
  12. Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
  13. Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
  14. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
  15. Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
  16. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
  17. Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).
  18. Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
  19. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  20. Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).

Play Video

Cite This Article
Osaki, T., Chow, S. Y. A., Nakanishi, Y., Hernández, J., Kawada, J., Fujii, T., Ikeuchi, Y. Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation. J. Vis. Exp. (163), e61544, doi:10.3791/61544 (2020).

View Video