En protokol til kultur den mikrosporidske parasit Edhazardia aedis. Parasitten er passage fra en generation af Aedes aegypti myg til den næste via vandret overførsel på larve fase efterfulgt af lodret transmission på voksen fase. Live sporoplasmer overlever på lang sigt i inficerede æg.
Edhazardia aedis er en mikrosporidian parasit af Aedes aegypti myg, en sygdom vektor, der overfører flere arbovirus, som forårsager millioner af sygdomstilfælde hvert år. E. aedis forårsager dødelighed og nedsat reproduktiv fitness i myg vektor og er blevet undersøgt for sit potentiale som en biocontrol agent. Den protokol, vi præsenterer for dyrkning E. aedis er baseret på sin naturlige infektion cyklus, som indebærer både vandret og lodret transmission på forskellige livsstadier af myg vært. Ae. aegypti myg er udsat for sporer i larve fase. Disse inficerede larver derefter modnes til voksne og overføre parasitten lodret til deres afkom. Inficerede afkom bruges derefter som en kilde til sporer til fremtidig horisontal transmission. Culturing E. aedis kan være udfordrende for de uindviede i betragtning af kompleksiteten af parasittens livscyklus, og denne protokol giver detaljeret vejledning og visuelle hjælpemidler til afklaring.
Aedes aegypti er myg vektor af flere arbovirus (f.eks denguefeber, Zika, gul feber), der tilsammen skønnes at tegne sig for hundreder af millioner af sygdomstilfælde hvert år og mere end 30.000 dødsfald1,2. Behandling af sygdomme forårsaget af disse patogener er begrænset til understøttende behandling, og det er sandsynligt, at yderligere arbovirus vil opstå i fremtiden3. Kontrol af myg vektor er derfor af primær betydning, da det effektivt forhindrer overførsel af nuværende og nye patogener4. Traditionelt vektor kontrol strategier primært udnytte kemiske insekticider, men resistens over for mange almindeligt anvendte insekticider har drevet efterspørgslen efter nye metoder til vektorkontrol. En potentiel agent, der er blevet undersøgt for sine biocontrol egenskaber mod Ae. aegypti er parasitten Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, først identificeret som Nosema aedis af Kudo i 1930, er en mikrosporidian parasit af Ae. aegypti myg7. Udviklingen og reproduktionen af E. aedis er forholdsvis kompleks , og dens livscyklus kan fortsætte på fleremåder 7,8,9. En fælles udviklingscyklus er beskrevet i dybden i Becnel et al., 19897 og anvendes til laboratorieformering (Figur 1)8. Kort, cyklussen begynder, når Ae. aegypti æg lodret inficeret med E. aedis klækkes i inficerede larver, der udvikler uninucleate sporer i fedt kroppen, og normalt dør som larver eller puppe. Uninucleate sporer frigivet fra døde larver forurener levested og indtages af sunde Ae. aegypti larver. Disse sporer spire primært i fordøjelseskanalen, inficere fordøjelsesvæv af de eksponerede larver, resulterer i vandret transmission. Horisontalt inficerede larver udvikle sig til voksne (forældre generation), hvor binukleat sporer dannes. Hos hunnen invaderer disse binucleatsporer forplantningsorganerne, og deres tilknyttede sporoplasme inficerer udvikle ægceller. Disse æg klækkes derefter til inficerede larver (filialgenerering), hvilket resulterer i vertikal overførsel af parasitten og fortsættelse af cyklussen som beskrevet ovenfor.
Flere undersøgelser har undersøgt potentialet i E. aedis for biocontrol. Infektion med E. aedis har vist sig at resultere i nedsat forplantningsevne af Ae. aegypti hunner10. I et semifelteksperiment resulterede den uundative udledning af E. aedis desuden i en fuldstændig udryddelse af en test Ae. aegypti-population, der holdes i et screenet indkapslingsområde6. Mens i stand til at gennemgå nogle faser af udviklingen i et mangfoldigt sæt af myg arter, E. aedis er kun vertikalt overføres i Ae. aegypti, hvilket indikerer en høj grad af vært specificitet11,12. På samme måde lykkedes det i en laboratorievurdering af den potentielle miljørisiko i forbindelse med E. aedis,at mikrosporiderparaten ikke inficerede ikke-mållevende akvatiske fauna, herunder rovdyr, der indtog Ae. aegypti larver inficeret med E. aedis13. Disse resultater fremhæver potentialet for, at E. aedis kan anvendes i biologiske bekæmpelsesstrategier rettet mod naturlige Ae. aegypti-populationer.
På trods af at E. aedis viser lovende til brug i vektor kontrol, der er udfordringer til dyrkning og implementering af det i bred skala. E. aedis sporer mister smitteevne på mindre end én dag ved kolde temperaturer (dvs. 5 °C). Selv ved varmere temperaturer (dvs. 25 °C) mister sporer hurtigt smitteevne i løbet af tre uger14. Derudover skal E. aedis dyrkes i levende Ae. aegypti myg og kontrolleret dosering af sunde larve myg er nødvendig for at sikre afslutningen af livscyklus og for at forhindre sammenbrud af befolkningen, der anvendes til kultur8. Kravet om in vivo-dyrkning udgør en udfordring; de seneste fremskridt inden for opdræt af myggemasser og robotteknologi (f.eks. Vi forventer, at visualisering af denne metode vil øge adgangen til E. aedis opdræt protokol og give flere forskere til at undersøge den grundlæggende biologi og anvendt potentiale i dette system. Vi forventer også, at det vil lette øget samarbejde med ingeniører, robotister, og den bredere teknologi sektor, som kan tjene til at forbedre masseopdragelse af E. aedis.
Figur 1: E. aedis propagation i Ae. aegypti. Formering af E. aedis begynder med udklækning E. aedis inficerede æg. Inficerede larver opdrættes til 4th instar, E. aedis sporer er isoleret fra disse larver, og sporerne bruges til oralt at inficere sunde 2 nd / 3rd instar larver opdrættet fra en ikke-inficeret kobling af æg(vandrettransmission). Disse oralt inficerede larver opdrættes derefter til voksenalderen (forældregeneration) og lægger æg inficeret med E. aedis (vertikal transmission). Inficerede æg (filial generation) derefter udklækket til at fortsætte infektionen cyklus og parasit kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vi præsenterer her den metode, der oprindeligt er beskrevet i Hembree og Ryan, 1982 8 tilopdræt E. aedis microsporidia i Ae. aegypti myg. Stammen af E. aedis anvendes i denne undersøgelse stammer fra den oprindelige feltsamling af Stephen Hembree i Thailand i 197919. Metoden udnytter den vandrette transmission, som naturligt forekommer i transmissionscyklussen af E. aedis7, for at udbrede parasitten på en kontrolleret måde. Denne metode kan være udfordrende for nytilkomne, der ikke er bekendt med spore udseende, symptomer på infektion i larver, eller den koordinering, der kræves for at fuldføre etape opdræt / dosing protokol. Vores håb er, at de visuelle hjælpemidler, der ledsager denne protokol vil reducere adgangsbarrierer for forskere, der ønsker at kultur E. aedis.
Vi formeret E. aedis i Ae. aegypti som beskrevet ovenfor og kvantificeret succes parasitisme i filial generation. Kort, vi udklækket E. aedis inficeret Ae. aegypti æg, opdrættet dem til 4th instar, og indsamlet uninucleate E. aedis sporer fra de inficerede larver. Vi derefter vandret inficeret sunde larver med disse sporer via oral indtagelse, og opdrættet vandret inficerede larver til voksenalderen. Vi blod fodret de inficerede voksne (forældrenes generation) og indsamlede æg (filial generation), som vi hypotese ville være lodret inficeret med E. aedis parasit. Vi udklækkede æg fra filialgenerationen og indsamlede og homogeniserede en delmængde af larverne, da de var 4th instars. Vi kvantificerede procentdelen af larver, der var inficeret med E. aedis og det samlede antal spore i alle smittede personer. Vi konstaterede, at langt de fleste (96 %) af personer blev smittet, og den gennemsnitlige spore belastning af inficerede larver var ~ 105. Vi konkluderer, at vores opdræt protokol resulterede i meget vellykket udbredelse af E. aedis i Ae. aegypti myg.
Der er flere aspekter af denne protokol, der kan være særligt udfordrende for den uindviede bruger. Nedenfor tilbyder vi nogle yderligere oplysninger, der kan være til hjælp. For spørgsmål vedrørende generelle myg opdræt, en komplet guide til Ae. aegypti koloni vedligeholdelse er uden for rammerne af denne protokol. Men mange almindelige spørgsmål kan løses ved hjælp af ressourcer fra Biodefense og Emerging Infektioner Research Resources Repository16,17 herunderæg udklækning, generelle kostbehov, bolig-og miljømæssige forhold, og blod fodring. Med hensyn til tidslinjen for infektion, larver udklækket fra inficerede æg viser ikke tegn på infektion, indtil sent i 4th instar fase. Uninucleate sporer vises hurtigt, i løbet af 1-2 dage. Larver kan forekomme næsten uinficeret efter 6 dage efter udklækning, men stærkt inficeret ved dag 7 eller 8 efter udklækning. Derudover kan det være udfordrende at visualisere sporer i homogeniserede prøver, fordi der er mange andre mikrober til stede i hele myg homogenater, herunder andre eukaryote encellede organismer (f.eks gær) af samme størrelse som E. aedis uninucleate sporer. Den karakteristiske form af E. aedis sporer (figur 2A) er en meget pålidelig metode til identifikation og vil bidrage til at skelne E. aedis fra andre mikrober i homogenatet. Selv om det ikke er nødvendigt for identifikation eller kvantificering, hvis spore rensning ønskes, kan det opnås via kolloid silica densitet gradient centrifugering, som vil give mulighed for adskillelse af E. aedis sporer fra andre forurenende elementer i homogenatet. Denne proces er beskrevet i detaljer i Solter et al.20.
Temperatur og kost, der anvendes i opdræt praksis almindeligt forskellige mellem laboratorier, men variationer vil sandsynligvis stadig give en vellykket parasit formering. Mindre forskelle i larvefødetype forstyrrer ikke vellykket infektion, selvom vi ikke udtrykkeligt har testet forskellige fødevaretyper i denne protokol. Temperaturens effekt på infektionen er blevet testet, og E. aedis-infektionen viste sig at være robust ved en lang række temperaturer21. Den maksimale sporeproduktion fandt sted ved 30,8 °C, men var stadig robust ved opdrætstemperaturer helt ned til 20 °C. Sporetallet blev reduceret drastisk ved højere opdrætstemperaturer (36 °C), og derfor bør disse temperaturer undgås for denne protokol.
Forurening er altid et problem, når man arbejder med parasitter. E. aedis er en vellykket parasit af Ae. aegypti og skal derfor holdes adskilt fra ikke-inficerede laboratoriekolonier for at forhindre kontaminering. Vi anbefaler opbevaring af inficerede myg i en separat inkubator, hvis det er muligt. Vi anbefalede også, at materialer, der anvendes til mikrosporidia arbejde (f.eks larvebakker, overførsel pipetter, bure, æg indsamling kopper) er udpeget til microsporidia arbejde og ikke anvendes mere bredt i hele insektær. Alle opdræt materialer bør steriliseres med 10% blegemiddel efter brug og autoclaving kan bruges til at supplere blegemiddel sterilisation.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Spencer Blankenship for hjælp med myg opdræt. Vi takker også James N. Radl og M. Dominique Magistrado for nyttig feedback på manuskriptet.
120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
Autoclave | For sterilization | ||
Bleach | For sterilization | ||
Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
Pipette 1 – 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
Pipette 100 – 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
Pipette tips 1 – 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
Pipette tips 100 – 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |