En protokoll for å kultur mikrosporidiske parasitten Edhazardia aedis. Parasitten er passasjer fra en generasjon Aedes aegypti mygg til neste via horisontal overføring på larvalstadiet etterfulgt av vertikal overføring på voksenstadiet. Levende sporoplasmer overlever langsiktig i infiserte egg.
Edhazardia aedis er en mikrosporidisk parasitt av Aedes aegypti mygg, en sykdomsvektor som overfører flere arbovirus som forårsaker millioner av sykdomstilfeller hvert år. E. aedis forårsaker dødelighet og redusert reproduktiv kondisjon i myggvektoren og har blitt utforsket for sitt potensial som biokontrollmiddel. Protokollen vi presenterer for å kultere E. aedis er basert på sin naturlige infeksjonssyklus, som innebærer både horisontal og vertikal overføring på forskjellige livsstadier av myggverten. Aegypti mygg er utsatt for sporer i larvalstadiet. Disse infiserte larver modnes deretter til voksne og overfører parasitten vertikalt til deres avkom. Infiserte avkom brukes deretter som en kilde til sporer for fremtidig horisontal overføring. Culturing E. aedis kan være utfordrende for de uinnvidde gitt kompleksiteten i parasittens livssyklus, og denne protokollen gir detaljert veiledning og visuelle hjelpemidler for avklaring.
Aedes aegypti er myggvektoren til flere arbovirus (f.eks. dengue, Zika, gul feber) som til sammen anslås å utgjøre hundrevis av millioner sykdomstilfeller hvert år og mer enn 30.000 dødsfall1,2. Behandling for sykdommer forårsaket av disse patogenene er begrenset til støttende omsorg, og det er sannsynlig at ytterligere arbovirus vil dukke opp i fremtiden3. Kontroll av myggvektoren er derfor av primær betydning, da den effektivt forhindrer overføring av nåværende og fremvoksende patogener4. Tradisjonelt bruker vektorkontrollstrategier primært kjemiske insektmidler, men motstand mot mange vanlige insektmidler har drevet etterspørselen etter nye metoder for vektorkontroll. En potensiell agent som har blitt utforsket for sine biokontrollegenskaper mot Ae. aegypti er parasitten Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, først identifisert som Nosema aedis av Kudo i 1930, er en mikrosporidisk parasitt av Ae. aegypti mygg7. Utviklingen og reproduksjonen av E. aedis er relativt kompleks og livssyklusen kan fortsette på fleremåter 7,8,9. En vanlig utviklingssyklus er beskrevet i dybden i Becnel et al., 19897 og benyttes til laboratorieforplantning (figur 1)8. Kort sagt begynner syklusen når Ae. aegypti egg vertikalt infisert med E. aedis luke inn i infiserte larver som utvikler uninukleate sporer i fettkroppen, og dør vanligvis som larver eller pupper. Uninukleate sporer utgitt fra døde larver forurenser habitatet og innta av sunne Ae. aegypti larver. Disse sporene spirer hovedsakelig i fordøyelseskanalen, smitter fordøyelsesvev av de eksponerte larver, noe som resulterer i horisontal overføring. Horisontalt infiserte larver utvikler seg til voksne (foreldregenerering) hvor binucleate sporer dannes. I kvinnen invaderer disse binucleate sporer reproduktive kanalen og deres tilhørende sporoplasm infiserer utvikle eggceller. Disse eggene klekkes deretter inn i infiserte larver (filial generasjon), noe som resulterer i vertikal overføring av parasitten og videreføring av syklusen som beskrevet ovenfor.
Flere studier har undersøkt potensialet til E. aedis for biokontroll. Infeksjon med E. aedis har vist seg å resultere i redusert reproduksjonsevne for Ae. aegypti kvinner10. Videre, i et semi-felt eksperiment, uoverkommelig utgivelse av E. aedis resulterte i total utryddelse av en test Ae. aegypti befolkningen holdt innenfor en screenet kabinett6. Mens i stand til å gjennomgå noen stadier av utvikling i et variert sett av myggarter, overføres E. aedis bare vertikalt i Ae. aegypti, noe som indikerer en høy grad av vertsspesifisitet11,12. Likeledes, i en laboratorievurdering av den potensielle miljørisikoen forbundet med E. aedis,klarte mikrosporidisk parasitt ikke å infisere ikke-mål akvatisk fauna, inkludert rovdyr som innsteg Ae. aegypti larver smittet med E. aedis13. Disse resultatene fremhever potensialet for E. aedis som skal brukes i biologiske kontrollstrategier rettet mot naturlige Ae. aegypti populasjoner.
Til tross for at E. aedis viser løfte om bruk i vektorkontroll, er det utfordringer med å kultere og distribuere den i bred skala. E. aedissporer mister infeksiøsitet på mindre enn én dag ved kalde temperaturer (f.eks. 5 °C). Selv ved varmere temperaturer (det vil at 25 °C) mister sporer raskt infeksiøsitet i løpet av tre uker14. I tillegg må E. aedis dyrkes i levende Ae. aegypti mygg og kontrollert dosing av sunne larve mygg er nødvendig for å sikre ferdigstillelse av livssyklusen og for å forhindre sammenbrudd av befolkningen som brukes til kultur8. Kravet om in vivo-kultivering byr på en utfordring; Imidlertid kan nylige fremskritt innen myggmasseoppdragelse og robotikk (f.eks. Massaro et al.15) tillate storskala generasjon av E. aedis sporer. Vi forventer at visualisering av denne metodikken vil øke tilgjengeligheten til E. aedis rearing protokollen og tillate flere forskere å undersøke grunnleggende biologi og anvendt potensial i dette systemet. Vi forventer også at det vil legge til rette for økt samarbeid med ingeniører, robotister og den bredere teknologisektoren, noe som kan bidra til å forbedre masseoppdrettingen av E. aedis.
Figur 1: E. aedis forplantning i Ae. aegypti. Forplantning av E. aedis begynner med klekking E. aedis infiserte egg. Infiserte larver er oppdratt til 4th instar, E. aedis sporer er isolert fra disse larver, og sporer brukes til å oralt infisere sunne andre / 3rd instar larver oppdratt fra enuinfisertclutch av egg (horisontal overføring). Disse orally infiserte larver blir deretter oppdratt til voksen alder (foreldregenerering) og legger egg infisert med E. aedis (vertikal overføring). Infiserte egg (filial generasjon) klekkes deretter for å fortsette infeksjonssyklusen og parasittkulturen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vi presenterer her metoden opprinnelig beskrevet i Hembree og Ryan, 19828 for oppdrett av E. aedis microsporidia i Ae. aegypti mygg. Stammen av E. aedis brukes i denne studien ble avledet fra den opprinnelige feltsamlingen av Stephen Hembree i Thailand i 197919. Metoden kapitaliserer på horisontal overføring, som naturlig forekommer i overføringssyklusen til E. aedis7, for å forplante parasitten på en kontrollert måte. Denne metoden kan være utfordrende for nykommere som ikke er kjent med spore utseende, symptomer på infeksjon i larver, eller koordinering som kreves for å fullføre multi-stage rearing / dosing protokollen. Vårt håp er at de visuelle hjelpemidler som følger med denne protokollen vil redusere barrierer for oppføring for forskere som ønsker å kultur E. aedis.
Vi forplantet E. aedis i Ae. aegypti som beskrevet ovenfor og kvantifiserte suksessen til parasitisme i filialgenerasjonen. Kort, vi klekket E. aedis infisert Ae. aegypti egg, oppdratt dem til 4th instar, og samlet uninucleate E. aedis sporer fra de infiserte larver. Vi smittet deretter horisontalt friske larver med disse sporene via oral inntak, og oppdro de horisontalt infiserte larver til voksen alder. Vi blod matet de smittede voksne (foreldregenerasjon) og samlet egg (filial generasjon), som vi hypotetisk ville være vertikalt smittet med E. aedis parasitten. Vi klekket egg fra filialgenerasjonen og samlet og homogeniserte en undergruppe av larver da de var4 th instars. Vi kvantifiserte prosentandelen av larver som var smittet med E. aedis og den totale sporetellingen hos alle infiserte individer. Vi fant at de aller fleste (96%) av individer ble smittet og gjennomsnittlig sporelast av infiserte larver var ~ 105. Vi konkluderer med at vår oppdrettsprotokoll resulterte i svært vellykket forplantning av E. aedis i Ae. aegypti mygg.
Det er flere aspekter ved denne protokollen som kan være spesielt utfordrende for den uinnvidde brukeren. Vi tilbyr under noen tilleggsinformasjon som kan være til hjelp. For spørsmål om generell myggoppdragelse er en komplett guide til Ae. aegypti kolonivedlikehold utenfor omfanget av denne protokollen. Imidlertid kan mange vanlige spørsmål løses av ressurser fra Biodefense og Emerging Infections Research Resources Repository16,17 inkludertegg klekking, generelle diettbehov, bolig og miljøforhold, og blodfôring. Når det gjelder infeksjonens tidslinje, viser larver klekket fra infiserte egg ikke tegn på infeksjon før sent i 4th instar-scenen. Uninukleate sporer vises raskt, i løpet av 1-2 dager. Larver kan virke nesten uinfiserte ved 6 dager etter klekking, men sterkt infisert av dag 7 eller 8 etter klekking. I tillegg kan det være utfordrende å visualisere sporer i homogeniserte prøver fordi det er mange andre mikrober tilstede i hele mygghomogenater, inkludert andre eukaryotiske encellede organismer (f.eks. gjær) av samme størrelse som E. aedis uninukleate sporer. Den karakteristiske formen på E. aedis sporer (Figur 2A) er en svært pålitelig metode for identifisering og vil bidra til å skille E. aedis fra andre mikrober i homogenatet. Selv om det ikke er nødvendig for identifisering eller kvantifisering, hvis spore rensing er ønsket, det kan oppnås via kolloidal silika tetthet gradient sentrifugasjon som vil tillate separasjon av E. aedis sporer fra andre forurensende elementer i homogenatet. Denne prosessen er beskrevet i detalj i Solter et al.20.
Temperatur og kosthold som brukes i oppdrettspraksis varierer vanligvis mellom laboratorier, men variasjoner vil sannsynligvis fortsatt gi vellykket parasittforplantning. Mindre forskjeller i larvalmattype forstyrrer ikke vellykket infeksjon, selv om vi ikke eksplisitt testet forskjellige mattyper i denne protokollen. Effekten av temperaturen på infeksjon er testet og E. aedis infeksjon ble funnet å være robust ved et bredt spekter av temperaturer21. Maksimal sporproduksjon forekom ved 30,8 °C, men var fortsatt robust ved oppringingstemperaturer så lavt som 20 °C. Antall sporer ble redusert dramatisk ved høyere oppvinningstemperaturer (36 °C), derfor bør disse temperaturene unngås for denne protokollen.
Forurensning er alltid en bekymring når du arbeider med parasitter. E. aedis er en vellykket parasitt av Ae. aegypti og må derfor holdes atskilt fra uinfiserte laboratoriekolonier for å forhindre forurensning. Vi anbefaler lagring av infiserte mygg i en egen inkubator hvis mulig. Vi anbefaler også at materialer som brukes til mikrosporidia arbeid (f.eks larve skuffer, overføring pipetter, bur, egg samling kopper) er utpekt for mikrosporidia arbeid og ikke brukes bredere i hele insektet. Alle oppdrettsmaterialer skal steriliseres med 10% blekemiddel etter bruk og autoklavering kan brukes til å supplere blekemiddelsterilisering.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Spencer Blankenship for hjelp med myggoppdragelse. Vi takker også James N. Radl og M. Dominique Magistrado for nyttig tilbakemelding på manuskriptet.
120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
Autoclave | For sterilization | ||
Bleach | For sterilization | ||
Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
Pipette 1 – 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
Pipette 100 – 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
Pipette tips 1 – 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
Pipette tips 100 – 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |