단백질의 빠른 광화학 산화는 단백질의 구조적 특성화를 위한 새로운 기술입니다. 다른 용매 첨가제와 리간드는 다양한 하이드록실 라디칼 청소 특성을 가지고 있습니다. 상이한 조건에서 단백질 구조를 비교하기 위해서는 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼의 실시간 보상이 반응 조건을 정상화하는 데 요구된다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질(FPOP)의 빠른 광화학 적 산화는 단백질의 용매 접근 표면적을 조사하는 질량 분광계 기반 구조 생물학 기술입니다. 이 기술은 하이드록실 라디칼이 자유롭게 용액에서 확산되는 아미노산 측면 사슬의 반응에 의존합니다. FPOP는 과산화수소의 레이저 광분해에 의해 이러한 라디칼을 시동하여 생성하여 마이크로초 의 순서로 고갈되는 하이드록실 라디칼의 파열을 생성합니다. 이러한 하이드록실 라디칼이 용매에 접근할 수 있는 아미노산 측 사슬과 반응할 때, 반응 제품은 질량 분광법에 의해 측정되고 정량화될 수 있는 질량 변화를 나타낸다. 아미노산의 반응 속도는 그 아미노산의 평균 용매 접근 표면에 부분적으로 의존하기 때문에, 단백질의 주어진 영역의 산화량의 측정된 변화는 서로 다른 적합성(예를 들어, 리간드 바운드 대 리간드 프리, 단백제 대 골합 등) 사이의 해당 영역의 용매 접근성의 변화와 직접 상관관계가 있을 수 있습니다. FPOP는 단백질 단백질 상호 작용, 단백질 형성 변화 및 단백질 리간드 결합을 포함하여 생물학에 있는 문제의 수에서 적용되었습니다. 하이드록실 라디칼의 사용 가능한 농도는 FPOP 실험에서 많은 실험 조건에 따라 다르기 때문에 단백질 해석이 노출되는 효과적인 라디칼 용량을 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 모니터링은 FPOP 반응에서 신호를 측정하기 위해 인라인 도지계를 통합하여 효율적으로 달성되며, 레이저 플루온은 원하는 양의 산화를 달성하기 위해 실시간으로 조정됩니다. 이러한 보상으로, 균형성 변화, 리간드 결합 표면 및/또는 단백질 단백질 상호 작용 인터페이스를 반영하는 단백질 지형의 변화는 상대적으로 낮은 시료양을 사용하여 이질적인 샘플에서 결정될 수 있다.
서론
단백질(FPOP)의 빠른 광화학 산화는 LC-MS1에의해 검출된 단백질의 용매 노출 표면적의 초고속 공유 변형에 의한 단백질 지형 변화를 측정하기 위한 새로운 기술이다. FPOP는 과산화수소의 UV 레이저 플래시 광분해에 의해 시상에서 고농도의 하이드록실 라디칼을 생성합니다. 이러한 하이드록실 라디칼은 매우 반응적이고 수명이 짧으며, FPOP 조건2하에서대략 마이크로초 단위로 소비된다. 이러한 하이드록실 라디칼은 물을 통해 확산되고 일반적으로 빠른(~106M -1 s-1)에서확산제어3에이르는 운동 속도로 용액의 다양한 유기 성분을 산화한다. 하이드록실 라디칼이 단백질 표면을 만날 때, 라디칼은 단백질 표면의 아미노산 측망을 산화시켜 그 아미노산의 질량 이동(가장 일반적으로 하나의 산소 원자의 순첨가)을 생성한다. 어떤 아미노산에서 산화 반응의 속도는 두 가지 요인에 따라 달라집니다: 그 아미노산의 고유 반응 (사이드 체인 및 서열 컨텍스트에 따라 달라집니다)4,,5
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프로토콜
1. 광학 벤치와 FPOP용 모세관 준비
주의: KrF 엑시머 레이저는 극도의 눈 의 위험이며, 직접 또는 반사된 빛은 영구적인 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 항상 적절한 눈 보호 기능을 착용하고, 가능한 경우 빔 경로 근처에 반사 물체가 있는지 방지하고, 엔지니어링 컨트롤을 사용하여 활성 레이저에 대한 무단 액세스를 방지하고 길 잃은 반사를 억제합니다.
- FPOP 옵티컬 벤치를 준비합니다.
- 레이저를 켜서 따뜻하게 합니다. 외부 트리거, 일정한 에너지, 가스 교체 없음으로 레이저를 설정합니다. 펄스당 레이저 에너지를 설정합니다(일반적으로 80-120 mJ/펄스 사이).
- 레이저 빔의 경로에 직접 평면 볼록 렌즈 (30mm Dia. x 120mm FL 코팅되지 않은)와 도 3A에표시된 빛을 흡수하는 비 반사 백스톱으로 광학 벤치를 설정합니다.
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결과
인산염 완충제에서 아달리무맙 바이오시밀러의 중사슬 펩티드 발자국을 비교하고 55°C에서 1h로 가열하면 흥미로운 결과를 나타낸다. 학생의 t-테스트는 이 두 가지 조건에서 크게 변경되는 펩티드의 식별에 사용됩니다 (p ≤ 0.05). 펩타이드 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 및 414-420은 단백질이 골재를 형성하도록 가열될 때 용매로부터 상당한 보호를나타낸다(도 5)30. 이 실험은 가열 및 집계시 지형 변화를 경험하는 펩티드 영역을 확인했습니다.
그림 5: 아달리무맙의 무거운 사슬의 펩티드 레벨 발자국.......
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토론
수소-중수소 교환, 화학 교차 연결, 공유 라벨링, 네이티브 스프레이 질량 분석 및 이온 이동성을 포함한 질량 분광계 기반 구조 기술은 유연성, 감도 및 복잡한 혼합물을 처리하는 능력으로 인해 빠르게 인기를 얻고 있습니다. FPOP는 질량 분석 기반 구조 기술 분야에서 인기를 강화한 몇 가지 장점을 자랑합니다. 대부분의 공유 라벨링 전략과 마찬가지로, 대부분의 포스트 라벨링 공정(예: 트립신 소화, 디글리코실레이션 등)과 호환되는 단백질 지형의 안정적인 화학 적 스냅샷을 제공하므로 수소 유두류 교환을 방해하는 백 교환 및 스크램블링 문제를 방지합니다. 그러나, 특정 아미노산을 대상으로 하는 전통적인 공유 라벨링 기술과는 달리, FPOP는 단일 실험에서 아미노산의 광범위 한 배열을 라벨수 있습니다. 더욱이, FPOP는 단백질보다 더 빠른 1차 하이드록실 라디칼 단백질 반응을 완료하여 네이티브형태(14)의화학적 스냅샷을 동결할 수 있지만, 일부 이차 반응은 느린 시간척도
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공개 사항
조슈아 S. 샤프는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국을 포함한 단백질 고주 구조 분석을 위한 기술을 상용화하고자 하는 소규모 회사인 GenNext Technologies, Inc.에 상당한 재정적 관심을 공개합니다.
감사의 글
우리는 고에너지 FPOP에 대한 표준화 및 dosimetry 프로토콜의 개발을위한 벤치 탑 FPOP 장치 및 R01GM127267의 상업적 개발을 지원하는 일반 의학 연구소의 연구 자금을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아데닌 | 아크로스 유기물 | 147440250 | 최대 3.5 mM의 물에 용해 |
| Edmund Optics | 39-905 | 1000 μ m 조리개 직경, 금도금 구리 조리개 | |
| 조리개 홀더 | Edmund Optics | 53-287 | 25.8mm 외경, 정밀 핀홀 마운트 |
| Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥ 10,000 units/mg 단백질 |
| COMPex Pro 레이저 | Coherent | 1113836 | COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF 레이저, No XeCl |
| Dithiotheitol (DTT) | Promega | V3151 | DTT, 분자 등급(DL-Dithiothreitol) |
| 분획 분취기 | GenNext Technologies, Inc. | N/A | 자동 분획 수집기 |
| 용융 실리카 capillay | Molex | 1068150023 | Polymicro Flexible 용융 실리카 모세관 튜브, 내경 100 & 마이크로; m, 외경 375 & 마이크로; m, TSP100375 |
| 글루타민 | 아크로스 유기물 | 119951000 | L(+)-글루타민, 99% |
| 렌즈 홀더 | Edmund Optics | 03-668 | 53mm 외경, 3나사 조절 가능한 링 마운트 |
| 과산화수소 | Fisher Scientific | H325-100 | 과산화수소, 30%(ACS 인증), Fisher Chemical |
| LC-MS/MS 시스템 | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPfadbmbcx | Orbitap Fusion Tribrid 질량 분석기에 결합된 Dionex Ultimate 3000 |
| Mas 사양 등급 Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
| 질량 분석기 등급 포름산 | Fisher Scientific | A117-50 | Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS 등급, 피셔 케미컬 |
| 질량 분석 등급 물 | 피셔 사이언티픽 | W6-4 | 물, 옵티마 LC/MS 등급, 피셔 케미컬 |
| MES 버퍼 | 시그마 알드리치 | M0164 | MES 헤미소듐 염 |
| 메티오닌 아미드 | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2. HCl |
| Micro V 클램프 | Thor Labs | VK250 | Micro V-클램프, 스테인리스 스틸 블레이드 |
| 포함 전동 스테이지 | Edmund Optics | 68-638 | 50mm 이동식 전동 스테이지 시스템, 수동 제어 |
| Nano C18 컬럼 | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼 |
| 광학 벤치 | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" 브레드보드 |
| FPOP 모듈 시스템의 선구자 | GenNext Technologies, Inc. | N/A | 인라인 FPOP 라디칼 선량 측정 시스템 |
| 포스트 홀더 | Edmund Optics | 58-979 | 3" 길이, ¼-20 스레드, 포스트 홀더 |
| 인산나트륨 이염기성 | Fisher Scientific | BP331-500 | 인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트 (무색-백색 결정), Fisher BioReagents |
| 인산나트륨 단일염기성 | Fisher Scientific | BP330-500 | 인산나트륨 일염기성 일수화물(무색에서 백색 결정), Fisher BioReagents |
| 주사기 | Hamilton | 81065 | 100 µ L, 모델 1710 RN SYR, 소형 탈착식 NDL, 22s ga, 2 in, 포인트 스타일 3 |
| 주사기 펌프 | KD Scientific | 788101 Legato 101 주사기 펌프 | |
| 트랩 C18 컬럼 | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼 |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 | Tris(hydroxymethyl)aminomethane |
| Trypsin | Promega | V5111 | 시퀀싱 등급 수정 트립신 |
| UV plano 볼록 렌즈 | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Dia. x 120 mm FL 비코팅, UV Plano-Convex Lens |
참고문헌
- Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
- Hambly, D. M., Gross, M. L.
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재인쇄 및 허가
