Målet med denne protokol er at syntetisere fluorescerende mærkede liposomer og bruge flowcytometri til at identificere in vivo-lokalisering af liposomer på celleniveau.
Der er en stigende interesse for at bruge liposomer til at levere forbindelser in vivo, især til målrettede behandlingsmetoder. Afhængigt af liposomformuleringen kan liposomer fortrinsvis optages af forskellige celletyper i kroppen. Dette kan påvirke effekten af den terapeutiske partikel, da progression af forskellige sygdomme er vævs- og celletypespecifik. I denne protokol præsenterer vi en metode til syntetisering og fluorescerende mærkning af liposomer ved hjælp af DSPC, kolesterol og PEG-2000 DSPE og lipidfarvestoffet DiD som en fluorescerende etiket. Denne protokol præsenterer også en tilgang til levering af liposomer in vivo og vurdering af cellespecifik optagelse af liposomer ved hjælp af flowcytometri. Denne tilgang kan bruges til at bestemme de typer celler, der optager liposomer og kvantificere fordelingen og andelen af liposomoptagelse på tværs af celletyper og væv. Selvom det ikke er nævnt i denne protokol, vil yderligere assays såsom immunofluorescens og enkeltcellefluorescensbilleddannelse på et cytometer styrke eventuelle fund eller konklusioner, da de tillader vurdering af intracellulær farvning. Det kan også være nødvendigt at tilpasse protokollerne afhængigt af det eller de pågældende væv.
Efterhånden som interessen for at udvikle terapier, der anvender nanopartikler drug delivery, vokser, skal metoderne til forberedelse og vurdering af partikelfordeling og optagelse fortsætte med at fremme, udvide og være tilgængelige for forskningssamfundet 1,2. Denne protokol blev udviklet til at vurdere de nøjagtige celletyper, der optog liposomer in vivo efter en behandling med DiD-mærkede liposomer fyldt med tesaglitazar, en peroxisomproliferatoraktiveret receptor (PPAR)-α/γ agonist 3,4. I disse undersøgelser var vi i stand til at vurdere, hvilke celletyper der blev direkte påvirket af liposomal tesaglitazarbehandling, effektiviteten af målretning af dele og generere hypoteser for at forklare de behandlingsresultater, vi observerede. Desuden tyder etablerede biologiske funktioner i en række celletyper på, at fagocytiske celler såsom makrofager, dendritiske celler og leverspecifikke Kupffer-celler optager de fleste liposomer 5,6,7. Ved hjælp af denne protokol har vi demonstreret, at ikke-klassiske fagocytter også kunne optage liposomer 3,4.
Denne protokol præsenterer en optimeret metode til opløselighed af tesaglitazar, fremstilling af liposomer ved omvendt fasefordampning og anvendelse af calciumacetat som tiltrækningsmiddel til fjernindlæsning af lægemidler. De præsenterede metoder er tilgængelige for mange laboratorier og mangler svært at erhverve materialer og trin, der kræver høje temperaturer. Protokollen producerer liposomer af størrelser, som er optimale til øget cirkulation in vivo8. Som opsummeret af Su et al. er metoder til evaluering af in vivo liposomfordeling og vævsoptagelse hidtil blevet undersøgt og testet i dybden9. Positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og fluorescensmolekylærtomografi (FMT) metoder anvendes til at kvantificere vævsspecifik biodistribution og optagelse 9,10,11. Mens disse metoder er optimeret til at maksimere detektion in vivo, mangler de stadig evnen til at kvantificere liposomoptagelse in vivo ved cellulær opløsning. Protokollen, der præsenteres her, sigter mod at opnå dette behov ved brug af flowcytometri. Endelig blev cellulær optagelse for denne protokol indsnævret til nogle få væv, herunder fedtvæv. Der er en voksende mængde litteratur, der undersøger potentialet for brug af nanopartikler til at levere terapier i forbindelse med fedme, dysmetabolisme og betændelse 12,13,14,15,16,17. Som sådan følte vi det vigtigt at dele en protokol med effektive metoder til behandling og analyse af fedtvæv – et af de væv, der spiller en vigtig rolle i disse patologier.
Her beskriver vi en tredelt protokol til (i) at forberede liposomer, der er mærket med et fluorescerende lipidfarvestof og fyldt med en antidiabetisk forbindelse, tesaglitazar, (ii) administrere liposomer til en mus via retro-orbital injektion og (iii) høste, behandle og plette væv for at detektere liposomoptagelse på celleniveau ved flowcytometri. Denne protokol gennemgår forberedelse af ca. 150 μm liposomer og vurdering af optagelse i fedt, blod og milt. Liposompræparatet er skalerbart, udføres hovedsagelig ved stuetemperatur og anvender omvendt fasefordampning for at maksimere lægemiddelbelastning og fjernelse af organiske opløsningsmidler. Ved hjælp af denne protokol kan der opnås op til 2 mg/ml tesaglitazarkoncentration i den oprensede liposomprøve. De tilberedte liposomer kan opbevares i HEPES-buffer ved 4 °C i over et år. Efter vores erfaring viste de minimal variation i gennemsnitlig partikelstørrelse. Under 10% af lægemiddelindholdstabet blev påvist spektrophotometrisk efter ultrafiltreringsseparation af liposomer fra eksternt lægemiddel med et 10 kDa centrifugalfilter.
Under liposomforberedelse er der nogle kritiske trin og faktorer at overveje. For det første er rækkefølgen af protokoltrinnene vigtig og skal overholdes. For det andet skal pH-værdien af den opløsning, der anvendes ved påfyldning af tesaglitazar, holdes på 7,4 for at maksimere opløseligheden og den effektive belastning. For det tredje sikrer korrekt montering af udstyr og filtre, at udgangen fra hvert trin er af den rette størrelse og renhed. For eksempel, hvis 100- og 200-nm filtre ikke er samlet korrekt, kan der opstå en mere heterogen og forkert størrelse batch af liposomer. For det fjerde er fuldstændig fjernelse af Ca-acetat før lægemiddelpåfyldning nødvendig for at maksimere overførslen af tesaglitazar til liposomerne. For at teste for fuldstændig fjernelse af Ca-acetat skal du bruge højhastighedssedimentering til at fjerne liposomerne og derefter måle Ca-acetatniveauer i den ikke-liposomale opløsning. For det femte er det vigtigt at veje og registrere massen af alle materialer, der tilsættes liposompræparatet ved hvert trin. Dette sikrer, at korrekte koncentrationer kan beregnes, og at de nødvendige forhold mellem materialer opretholdes. Endelig, hvis teknikken ikke udføres korrekt, kan der være et uønsket niveau af heterogenitet. Det er vigtigt at kontrollere denne parameter grundigt ved hjælp af DLS og andre tilgange såsom elektronmikroskopi. For at forbedre homogeniteten kan du overveje at justere den valgte filterstørrelse eller stable to filtre.
Derudover er det afgørende, at kontroller og et antistofpanel til flowcytometri planlægges og optimeres, inden denne protokol udføres fuldt ud (tabel 1, tabel 3). Antistoffer bør testes for at sikre, at der anvendes korrekte koncentrationer til farvning, og at overlapningen mellem fluoroforer er minimal. Excitationen og emissionen af farvestoffet, der anvendes under liposompræparation, skal også indregnes i panelplanlægningen. I vores resultater brugte vi DiD, som har en lignende excitation og emission til fluoroforer som Allophycocyanin (APC) og AlexaFluor 647. Således valgte vi ikke antistoffer konjugeret mod disse fluoroforer i vores antistofpanel. Desuden er isotypekontroller ikke omfattet af denne protokol. Dette skyldes, at de antistoffer, der er valgt til denne protokol, er velvaliderede, kommercielt tilgængelige antistoffer. Men hvis du er interesseret i at bruge et antistof, der ikke tidligere er optimeret, skal du overveje at teste antistoffet mod en isotypekontrol på det interessante væv, inden du udfører det fulde eksperiment.
Mens denne protokol viser, hvordan man ekstraherer og behandler blod, milt, lyskefedt og epididymalt fedtvæv fra musens efterbehandling, kan denne generelle tilgang anvendes på andre væv. Afhængigt af det interessante væv kan det være nødvendigt at ændre behandlings- og fordøjelsesprotokollerne, som det er offentliggjort for følgende væv: lunge21, lever22, bughule 3, knoglemarv3,23, hjerne 24.
En vigtig begrænsning ved denne metode er, at optagelsen kun kan vurderes på ét tidspunkt pr. dyr. Det kan således være en fordel at koble denne protokol med andre ikke-invasive billeddannelsesteknikker eller planlægge i overensstemmelse hermed for at sikre tilstrækkelige ressourcer til at gennemføre vurderingen. Tidspunktet for cellulær optagelse og cellulær omsætning er vigtige faktorer at overveje: liposomer cirkulerer gennem hele kroppen i de første 24 timer, og afhængigt af levetiden for de celler, der optager liposomer, eller hvordan de reagerer på optagelse, kan celledød eller yderligere fagocytose forekomme. Vores tidligere undersøgelse viste ændringer i populationskarakteristika for DiD + populationer på forskellige tidspunkter3. Derfor er det vigtigt at evaluere optagelsen på tidligere tidspunkter eller tidspunkter, der er mest relevante for interessemekanismens biologi. Derudover, mens kvantificering af celleoptagelse i hele vævet kan udføres med denne protokol, kan flowcytometri ikke afsløre vævslokalisering. Kobling af denne tilgang med histologiske metoder kan bidrage til at løse denne begrænsning.
Generelt supplerer denne protokol eksisterende metoder såsom histologi og helkropsfluorescensbilleddannelse. Med de fortsatte fremskridt inden for flowcytometriværktøjer og -metoder vil udviklingen af større paneler til flere og flere specifikke cellepopulationer blive mulig. Vi foreslår, at denne protokol bruges ud over de ovennævnte metoder, da dette vil forbedre evalueringen af cellulær optagelse og også give mulighed for at validere de resultater, der observeres ved flowcytometri. For eksempel skal det konstateres, at et flertal af partiklerne i fedtvæv blev optaget af makrofager ved flowcytometri. Immunofluorescens af en yderligere delprøve af det samme fedtvæv kunne gemmes, fikseres, sektioneres og farves til makrofagmarkører for at verificere, at celletypen faktisk optager liposomer. Denne tilgang bør tilføje stringens til nanopartikelbiodistributionsassays udført: validering af cellespecifik målretning, kvantificering af cellulær optagelse, identifikation af optagelse uden for målet og forhåbentlig tilvejebringelse af information til generering af mekanistiske hypoteser for observerede terapeutiske resultater. Denne protokol kan også tilpasses til fremtidige undersøgelser ved hjælp af forskellige liposomer, undersøge optagelse i andre væv og teste nye forbindelser i forbindelse med fedme og dysmetabolisme eller enhver anden sygdom, hvor nanopartikellevering er en mulig terapeutisk mulighed.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Michael Solga og resten af Flow Cytometry Core-personalet for at levere flowcytometritræning og -tjenester. Forfatterne vil også gerne anerkende Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye og Prasad Srikakulapu for deres hjælp med liposompræparation (SSKD, DKB), vævshøst (MAM, JCG) og flowcytometrifarvning og prøveerhvervelse (AU, PS, CM). Dette arbejde blev støttet af tilskud fra AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 og R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 og T32 HL007284.
1-mL syringe | BD | 309659 | |
10-mL syringe | BD | 302995 | |
25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
Sonicator | Misonix | XL2020 | |
T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |