सीरोटाइप 1 स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया स्ट्रेन 519/43 में उत्परिवर्ती का निर्माण
Summary
यहां, हम एक एस निमोनिया सीरोटाइप 1 स्ट्रेन 519/43 का वर्णन करते हैं जिसे स्वाभाविक रूप से डीएनए और आत्महत्या-प्लास्मिड प्राप्त करने की क्षमता का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, न्यूमोलिसिन (प्लाई) जीन में एक इसोजेनिक उत्परिवर्ती बनाया गया था।
Abstract
स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया सीरोटाइप 1 कम और मध्यम आय वाले देशों में एक बड़ी समस्या बनी हुई है, खासकर उप-सहारा अफ्रीका में। इसके महत्व के बावजूद, इस सीरोटाइप में अध्ययन इसे संशोधित करने के लिए आनुवंशिक उपकरणों की कमी से बाधित हुआ है। इस अध्ययन में, हम आनुवंशिक रूप से एक सीरोटाइप 1 नैदानिक अलगाव (तनाव 519/43) को संशोधित करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि यह न्यूमोकोकस की स्वाभाविक रूप से डीएनए प्राप्त करने की क्षमता का फायदा उठाकर हासिल किया गया था। हालांकि, अधिकांश न्यूमोकोकी के विपरीत, रैखिक डीएनए का उपयोग सफल नहीं था; इस महत्वपूर्ण तनाव को उत्परिवर्तित करने के लिए, एक आत्मघाती प्लास्मिड का उपयोग किया जाना था। इस पद्धति ने इस मायावी सीरोटाइप की गहरी समझ के लिए साधन प्रदान किए हैं, दोनों इसके जीव विज्ञान और रोगजनकता के संदर्भ में। विधि को मान्य करने के लिए, प्रमुख ज्ञात न्यूमोकोकल विष, न्यूमोलिसिन, उत्परिवर्तित था क्योंकि इसमें एक प्रसिद्ध और पालन करने में आसान फेनोटाइप है। हमने दिखाया कि उत्परिवर्ती, जैसा कि अपेक्षित था, लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने की अपनी क्षमता खो देता है। रुचि के सीरोटाइप में एक महत्वपूर्ण जीन को उत्परिवर्तित करने में सक्षम होने से, हम अन्य सीरोटाइप के लिए देखे गए लोगों से इंट्रापरिटोनियल और इंट्रानेसल संक्रमणों पर फ़ंक्शन म्यूटेंट के नुकसान के लिए अलग-अलग फेनोटाइप का निरीक्षण करने में सक्षम थे। सारांश में, यह अध्ययन साबित करता है कि तनाव 519/43 (सीरोटाइप 1) आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है।
Introduction
स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (एस निमोनिया, न्यूमोकोकस) विश्व स्तर पर रुग्णता और मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक है। हाल ही में, एस निमोनिया के 100 सीरोटाइप के करीब 1,2,3,4,5,6,7 की खोज की गई है। वार्षिक रूप से, इनवेसिव न्यूमोकोकल रोग (आईपीडी) 5 साल से कम उम्र के बच्चों की लगभग 700,000 मौतों का दावा करताहै। एस निमोनिया दुनिया भर में बैक्टीरियल निमोनिया, ओटिटिस मीडिया, मेनिन्जाइटिस और सेप्टिसीमिया का प्रमुख कारणहै।
अफ्रीकी मेनिन्जाइटिस बेल्ट में, सीरोटाइप 1 मेनिन्जाइटिस के प्रकोप के लिए जिम्मेदार है, जहां अनुक्रम प्रकार (एसटी) एसटी 217, एक अत्यंत विषाक्त अनुक्रम प्रकार, प्रमुख 10,11,12,13,14,15 है। मेनिन्जाइटिस पैथोलॉजी में इसके महत्व की तुलना अफ्रीकी मेनिन्जाइटिस बेल्ट16 में नीसेरिया मेनिन्जाइटिस से की गई है। सीरोटाइप 1 अक्सर आईपीडी का मुख्य कारण होता है; हालाँकि, यह गाड़ी में बहुत कम पाया जाता है। वास्तव में, गाम्बिया में, यह सीरोटाइप सभी आक्रामक रोग के 20% के लिए जवाबदेह है, लेकिन यह केवल 14,17,18,19 स्वस्थ वाहक के 0.5% में पाया गया था। सक्षम न्यूमोकोकी में आनुवंशिक विनिमय और पुनर्संयोजन आम तौर पर आक्रामक रोग20 के बजाय गाड़ी में होता है। इसके अलावा, सीरोटाइप 1 को न्यूमोकोकी (केवल 9 दिन) के बीच वर्णित सबसे छोटी गाड़ी दरों में से एक दिखाया गया है। इसलिए, यह प्रस्तावित किया गया है कि इस सीरोटाइप में दूसरों की तुलना में बहुत कम पुनर्संयोजन दर हो सकतीहै।
सीरोटाइप 1 उपभेदों की गाड़ी की कम दर और उप-सहारा अफ्रीका में आक्रामक बीमारी में इसके महत्व के पीछे के कारण को समझने के लिए गहराई से अध्ययन आवश्यक हैं।
यहां हम एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जो एक विशेष सीरोटाइप 1 स्ट्रेन, 519/43 के जीनोम-वाइड म्यूटेनेसिस की अनुमति देता है। यह स्ट्रेन आसानी से अपने जीनोम में नए डीएनए को प्राप्त और पुनर्संयोजित कर सकता है। यह विधि अभी तक अंतर-तनाव नहीं है, लेकिन यह 519/43 पृष्ठभूमि में किए जाने पर बहुत कुशल है (अन्य लक्ष्यों को उत्परिवर्तित किया गया है, पांडुलिपियां तैयार की गई हैं)। केवल 519/43 तनाव का उपयोग करके, और इसकी प्राकृतिक क्षमता का फायदा उठाकर, साथ ही बहिर्जात डीएनए प्रदान करने के तरीके को प्रतिस्थापित करके, हम इस सीरोटाइप 1 तनाव में न्यूमोलिसिन जीन (प्लाई) को उत्परिवर्तित करने में सक्षम थे। यह विधि हार्वे एट अल.22 द्वारा प्रस्तुत एक पर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करती है क्योंकि यह एक अलग सीरोटाइप के माध्यम से डीएनए को पारित करने की आवश्यकता के बिना एक-चरण में किया जाता है। फिर भी, और अंतर-तनाव परिवर्तनशीलता के कारण, सभी उपभेदों के लिए कोई विधि मानकीकृत नहीं की गई है। विशिष्ट जीनों को उत्परिवर्तित करने और इसके प्रभावों का निरीक्षण करने की क्षमता सीरोटाइप 1 एस निमोनिया उपभेदों की गहन समझ की अनुमति देगी और यह उप-सहारा अफ्रीका में मेनिन्जाइटिस में इन उपभेदों की भूमिका के लिए उत्तर प्रदान करेगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया, विशेष रूप से सीरोटाइप 1, आक्रामक न्यूमोकोकल बीमारी और मेनिन्जाइटिस के कारण एक वैश्विक खतरा बना हुआ है। अफ्रीका में सीरोटाइप 1 के खिलाफ सुरक्षात्मक होने वाले विभिन्न टीकों…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मेनिनजाइटिस ट्रस्ट और एमआरसी को इस काम के लिए धन प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
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