Summary

Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43

Published: September 11, 2020
doi:

Summary

Qui, descriviamo un sierotipo 1 di S. pneumoniae ceppo 519/43 che può essere geneticamente modificato utilizzando la sua capacità di acquisire naturalmente DNA e un plasmide suicida. Come prova di principio, è stato creato un mutante isogeno nel gene della pneumolisina (compensato).

Abstract

Il sierotipo 1 di Streptococcus pneumoniae rimane un problema enorme nei paesi a basso e medio reddito, in particolare nell’Africa sub-sahariana. Nonostante la sua importanza, gli studi su questo sierotipo sono stati ostacolati dalla mancanza di strumenti genetici per modificarlo. In questo studio, descriviamo un metodo per modificare geneticamente un isolato clinico del sierotipo 1 (ceppo 519/43). È interessante notare che questo è stato ottenuto sfruttando la capacità dello Pneumococco di acquisire naturalmente il DNA. Tuttavia, a differenza della maggior parte degli pneumococchi, l’uso del DNA lineare non ha avuto successo; Per mutare questo importante ceppo, è stato necessario utilizzare un plasmide suicida. Questa metodologia ha fornito i mezzi per una comprensione più profonda di questo sierotipo elusivo, sia in termini di biologia che di patogenicità. Per convalidare il metodo, la principale tossina pneumococcica conosciuta, la pneumolisina, è stata mutata perché ha un fenotipo ben noto e facile da seguire. Abbiamo dimostrato che il mutante, come previsto, ha perso la sua capacità di lisare i globuli rossi. Essendo in grado di mutare un gene importante nel sierotipo di interesse, siamo stati in grado di osservare diversi fenotipi per la perdita di funzione mutanti su infezioni intraperitoneali e intranasali da quelli osservati per altri sierotipi. In sintesi, questo studio dimostra che il ceppo 519/43 (sierotipo 1) può essere geneticamente modificato.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, lo pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello globale. Fino a poco tempo fa, sono stati scoperti quasi 100 sierotipi di S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ogni anno, la malattia pneumococcica invasiva (IPD) rivendica circa 700.000 decessi, di bambini di età inferiore ai 5 anni8. S. pneumoniae è la principale causa di polmonite batterica, otite media, meningite e setticemia in tutto il mondo9.

Nella cintura africana della meningite, il sierotipo 1 è responsabile delle epidemie di meningite, dove il tipo di sequenza (ST) ST217, un tipo di sequenza estremamente virulento, è dominante 10,11,12,13,14,15. La sua importanza nella patologia della meningite è stata paragonata a quella di Neisseria meningitidis nella cintura africana della meningite16. Il sierotipo 1 è spesso la causa principale dell’IPD; tuttavia, si trova molto raramente in carrozza. Infatti, in Gambia, questo sierotipo è responsabile del 20% di tutte le malattie invasive, ma è stato trovato solo nello 0,5% dei portatori sani14,17,18,19. Lo scambio genetico e la ricombinazione negli pneumococchi competenti avvengono generalmente nel trasporto piuttosto che nella malattia invasiva20. Inoltre, il sierotipo 1 ha dimostrato di avere uno dei tassi di trasporto più brevi descritti tra gli pneumococchi (solo 9 giorni). Pertanto, è stato proposto che questo sierotipo potrebbe avere un tasso di ricombinazione molto più basso rispetto ad altri21.

Sono necessari studi approfonditi per comprendere il motivo del basso tasso di trasporto dei ceppi del sierotipo 1 e la sua importanza nelle malattie invasive nell’Africa sub-sahariana.

Qui riportiamo un protocollo che consente la mutagenesi genome-wide di un particolare ceppo di sierotipo 1, 519/43. Questo ceppo può facilmente acquisire e ricombinare nuovo DNA nel suo genoma. Questo metodo non è ancora inter-sforzo, ma è molto efficiente se fatto in background 519/43 (altri obiettivi sono stati mutati, manoscritti in preparazione). Semplicemente utilizzando il ceppo 519/43 e sfruttando la sua competenza naturale, oltre a sostituire il modo in cui viene fornito il DNA esogeno, siamo stati in grado di mutare il gene della pneumolisina (ply) in questo ceppo sierotipo 1. Questo metodo rappresenta un miglioramento rispetto a quello presentato da Harvey et al.22 in quanto viene fatto in un unico passaggio senza la necessità di far passare il DNA attraverso un sierotipo diverso. Tuttavia, e a causa della variabilità tra i ceppi, nessun metodo è stato standardizzato per tutti i ceppi. La capacità di mutare geni specifici e osservarne gli effetti permetterà una profonda comprensione dei ceppi di sierotipo 1 S. pneumoniae e fornirà risposte per il ruolo di questi ceppi nella meningite nell’Africa sub-sahariana.

Protocol

1. Generazione dell’amplicone mutante mediante SOE-PCR23 e amplificazione della cassetta della spectinomicina Inizia eseguendo la PCR per l’amplificazione dei bracci di omologia (ply 5′ (488 bp) e ply3′ (715 bp) rispettivamente) delle regioni fiancheggianti del gene ply dal ceppo 519/43. Utilizzare primer plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5’R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3’F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC…

Representative Results

Il protocollo qui descritto inizia utilizzando la PCR per amplificare i bracci di omologia sinistro e destro, eliminando contemporaneamente 191 bp dalla regione centrale del gene ply . Durante l’esecuzione della PCR viene introdotto un sito BamHI al 3′ del braccio di omologia sinistro e all’estremità 5′ del braccio di omologia destro (Figura 1A). Questo è seguito da PCR-SOE dove i bracci di omologia sinistro e destro sono fusi in un unico amplicone (Figura 1B<…

Discussion

Streptococcus pneumoniae, in particolare il sierotipo 1, continua ad essere una minaccia globale che causa malattie invasive da pneumococco e meningite. Nonostante l’introduzione di vari vaccini che dovrebbero essere protettivi contro il sierotipo 1, in Africa, questo sierotipo è ancora in grado di causare epidemie che portano ad alta morbilità e mortalità13. La capacità di manipolare geneticamente questo sierotipo è di fondamentale importanza a causa della sua rilevanza clinica. Il …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il Meningitis Trust e il MRC per aver fornito finanziamenti per questo lavoro.

Materials

AccuPrime Pfx DNA polymerase Invitrogen 12344024 Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base Oxoid CM0055 Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine sigma 55470 used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion Oxoid CM1135 used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2 Sigma 449709 used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1 AnaSpec AS-63779 used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar Gibco 22700025 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation) Gibco 12795027 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit NEB T1020S Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy Promega A1360 used as suicide plasmid
S.O.C. Invitrogen 15544034 used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S0899 used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride SigmaAldrich PHR1426 Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265017 used for the creation of pSD1 and pSD2

References

  1. Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
  2. Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
  3. Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
  4. Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
  5. Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
  6. Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
  7. Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
  8. O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
  9. Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
  10. Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
  11. Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
  12. Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
  13. Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
  14. Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
  15. Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
  16. Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
  17. Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
  18. Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
  19. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
  20. Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
  21. Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
  22. Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
  23. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
  24. Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
  25. Lund, E. . Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
  26. Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
  27. Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
  28. Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
  29. Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
  30. Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).

Play Video

Cite This Article
Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43. J. Vis. Exp. (163), e61594, doi:10.3791/61594 (2020).

View Video