Visualización de dinámicas diffusionales de nanorods de oro en la membrana celular mediante microscopía de campo oscuro de nanopartícula única
Summary
Aquí, mostramos el uso de microscopía tradicional de campo oscuro para monitorear la dinámica de los nanorods de oro (AuNRs) en la membrana celular. La ubicación y orientación de los AuNR únicos se detectan utilizando ImageJ y MATLAB, y los estados difusivos de los AUNR se caracterizan por un solo análisis de seguimiento de partículas.
Abstract
El análisis de la dinámica diffusional de las nanopartículas en la membrana celular desempeña un papel importante en la mejor comprensión del proceso de absorción celular y proporciona una base teórica para el diseño racional de la administración de nanomedicación. El análisis de seguimiento de partículas únicas (SPT) podría sondear la posición y orientación de nanopartículas individuales en la membrana celular, y revelar sus estados traslacionales y rotacionales. Aquí, mostramos cómo utilizar la microscopía tradicional de campo oscuro para monitorear la dinámica de los nanorods de oro (AuNRs) en la membrana celular viva. También mostramos cómo extraer la ubicación y orientación de auNRs utilizando ImageJ y MATLAB, y cómo caracterizar los estados difusos de auNRs. El análisis estadístico de cientos de partículas muestra que un solo AuNRs realiza movimiento browniano en la superficie de la membrana celular U87 MG. Sin embargo, el análisis individual de larga trayectoria muestra que los AUNR tienen dos tipos de valores de movimiento claramente diferentes en la membrana, a saber, el transporte de largo alcance y el confinamiento de área limitada. Nuestros métodos SPT se pueden utilizar potencialmente para estudiar la difusión de partículas superficiales o intracelulares en diferentes células biológicas y pueden convertirse en una poderosa herramienta para investigaciones de mecanismos celulares complejos.
Introduction
La dinámica de las nanopartículas (NPs) en la membrana está estrechamente asociada con el proceso de absorción celular, que es esencial para la comprensión de las funciones celulares, infecciones virales o bacterianas y el desarrollo de sistemas de administración nanomédica artificial1,2. La técnica de seguimiento de partículas únicas (SPT) es una herramienta robusta para caracterizar los comportamientos heterogéneos de los NPs3,4. En general, la membrana celular es fluida, lo que significa que los componentes como proteínas y lípidos pueden moverse lateralmente en el plano de membrana plasmática5,6,7. La complejidad espaciotemporal de la organización y estructura de la membrana puede conducir a la heterogeneidad espaciotemporal de la interacción entre los NPs y la membrana. Por lo tanto, la visualización directa del movimiento de los NPs en la membrana requiere una alta resolución espacial y temporal.
Microscopía de seguimiento de partículas únicas que monitorea la localización de partículas individuales en células vivas con una resolución espacial de decenas de nanómetros y una resolución de tiempo de milisegundos ha sido bien desarrollada para estudiar los NPs o moléculas de membrana dinámica8,9. Las técnicas de imágenes microscópicas basadas en fluorescencia se han convertido en valiosas herramientas para observar NPs/moléculas en entornos celulares vivos9,10,11,12. Por ejemplo, la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, que muestra capas delgadas (~100 nm) de la muestra en la interfaz de sustrato/solución con una alta resolución espaciotemporal ha sido ampliamente utilizada en estudios de moléculas de membrana dinámica13,14. Sin embargo, las desventajas inherentes de los fluoróforos individuales, como la baja intensidad y el fotobleaching irreversible rápido reducen la precisión y la duración del seguimiento13. Por lo tanto, los NPs plásmidos no fluorescentes, que reemplazan a las sondas fluorescentes, han atraído cada vez más atención en estudios de imágenes a largo plazo debido a sus características ópticas únicas15. Basándose en las señales de dispersión de las sondas np plásmidas, se han utilizado varios tipos de tecnologías ópticas de imágenes microscópicas para estudiar el mecanismo de procesos biológicos, como microscopía de campo oscuro (DFM)16,microscopía de dispersión interferométrica (iSCAT)17 y microscopía de contraste de interferencia diferencial (DICM)18. Además, la dinámica de movimiento y rotación de auNRs se puede obtener utilizando DFM y DICM18,19,20,21,22. Normalmente, en un experimento SPT, el microscopio óptico registra el movimiento del objeto y, a continuación, se analiza mediante métodos de análisis SPT3. Las trayectorias resueltas en el tiempo y los ángulos de orientación generados por los NPs individuales son normalmente estocásticos y heterogéneos, por lo que es necesario presentar abundante información dinámica con varios métodos de análisis.
Aquí, proporcionamos un protocolo integrado que monitorea la dinámica de auNRs en la membrana celular utilizando DFM, extrae la ubicación y orientación de auNRs con ImageJ y MATLAB y caracteriza la difusión de auNRs con métodos de análisis SPT. Como demostración, aquí mostramos cómo utilizar el protocolo SPT para visualizar dinámicas de AUNRs no modificados (CTAB-AuNRs, sintetizados por molécula de bromuro de amonio de cetiltrimetillammonium como agente protector) en la membrana celular U87 MG. Se ha demostrado que los TTAB-AUNR pueden adsorberar proteínas en el entorno biológico, moverse sobre la membrana celular y luego entrar en las células2,20,22. Células de MG U87 es el tumor más común y más maligno del sistema nervioso central, y sus receptores de membrana se expresan anormalmente. Los receptores de membrana pueden interactuar con proteínas en auNRs, que influyen en la dinámica de auNRs. Nuestro protocolo es generalmente aplicable a otros experimentos SPT en el campo de la biología.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado se utiliza para estudiar la dinámica de los AUNRs en la membrana celular. El protocolo consta de cuatro partes, incluyendo imágenes microscópicas, extracción de datos, métodos de cálculo de parámetros dinámicos y análisis de datos, y cada parte es flexible y universal. Por lo tanto, hay muchas aplicaciones futuras posibles, por ejemplo, estudiando el movimiento de moléculas de membrana vinculadas a NP en la membrana, dinámica de endocitosis de receptores etiquetados np, análisis dinám…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China con números de subvención de 21425519, 91853105 y 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
