Vi beskriver en simpel protokol til at udvikle mucociliære epitelorganoider fra dybe ectoderm celler isoleret fra Xenopus laevis embryoner. De multipotente forfædre regenererer epitelcelleprækursorer og tillader direkte sporing af initieringen og progressionen af celleovergangene på overfladen af organoider.
Mucociliary epitel giver den første linje i forsvaret ved at fjerne fremmede partikler gennem handling af slim produktion og cilia-medieret clearance. Mange klinisk relevante defekter i mucociliary epitel udledes, da de forekommer dybt inde i kroppen. Her introducerer vi en tractable 3D-model for mucociliary epitel genereret fra multipotente forfædre, der var mikrokirurgisk isoleret fra Xenopus laevis embryoner. De mucociliære epitelorganoider er dækket med nygenererede epitel fra dybe ectoderm celler og senere dekoreret med forskellige mønstrede multikilierede celler, sekretoriske celler, og slim-producerende bæger celler, der ikke kan skelnes fra den indfødte epidermis inden for 24 h. Den fulde sekvenser af dynamiske celle overgange fra mesenkymal til epitel, der opstår på den apikale overflade af organoider kan spores ved høj opløsning levende billeddannelse. Disse in vitro-kultiverede, selvorganiserende mucociliære epitelorganoider giver klare fordele ved at studere mucociliary epitels biologi med høj effektivitet i generation, definerede kulturforhold, kontrol over antal og størrelse og direkte adgang til levende billeddannelse under regenerering af det differentierede epitel.
Skade, infektion og sygdom i mucociliary epitel er forbundet med nedsat produktion og clearance af slim, som ofte findes i lungesygdomme såsom kronisk obstruktiv lungesygdom, astma, cystisk fibrose, bronchiectasis, og primær ciliaere dyskinesi1,2,3,4. En nylig fremskridt inden for organoid teknologi, for eksempel, de basalcellebaserede lungeorganoid kaldet tracheosphere, der opsummerer regenerering af mucociliary epitel opstå som en lovende model med terapeutisk potentiale1,5,6. Anvendelsen af den er imidlertid i øjeblikket begrænset, til dels på grund af manglende af de definerede kulturforhold og lav effektivitet i organoidproduktioner. Mucociliary epitel i de menneskelige luftveje og frøen epidermis er bemærkelsesværdigt ens i væv morfologi, cellulære sammensætning, og densfunktion 7,8,9,10,11,12. I begge organismer, mucociliary epitel giver første-line forsvar ved at udskille slim og antimikrobielle stoffer og rydder skadelige partikler og patogener gennem synkroniseret virkning af cilier.
Her beskriver vi en simpel protokol til at generere mucociliary epitelorganoider ved hjælp af multipotente stamfædre af Xenopus laevis embryoner13,14. Tidligere rapporterede vi14, at i mangel af udefrakommende vækstfaktorer og den ekstracellulære matrix, de mikrokirurgisk isolerede dybe celler fra den tidlige gastrula fase ectoderm spontant samles i aggregater, regenerere epitel på dens overflade, og modnes i mucociliary epitel ved intercalating multiciliated og andre tilbehørsceller inden for 24 h. Ud over den hurtige udvikling, denne protokol giver en klar mulighed for direkte adgang til overgange af multipotente dybe ectoderm celler i epitel bægercelle forfædre, der opsummerer regenerering trin af en forstyrret epitel14, som ikke er tilgængelige fra intakte embryoner og ektoderm (også kendt som dyret cap)15,16,17. Antallet og størrelsen af de producerede organoider kan skaleres med høj effektivitet ved at kontrollere udgangsmaterialerne fra Xenopus embryoner. Organoider i flydende kultur kan nemt sorteres og overføres på det ønskede stadium for yderligere analyser, herunder høj opløsning billeddannelse, mekanisk testning, narkotikabehandling, og genetisk karakterisering14. Denne spontane, vævsmekanik-drevet regenerering af epitel på overfladen af embryonale celle aggregater resulterer i mucociliary epitelorganoider og give en ny tre-dimensionel (3D) model til at studere biologi mucociliary epitel.
Mucociliary epitelorganoider genereret fra dybe ectoderm celler af X. laevis embryo er et effektivt redskab til at studere epitelisering og differentiering af multipotente forfædre in vitro. I modsætning til den bredt vedtagne dyreloftsanalyse16, der anvendes til in vitro organogenese13, og udviklingen af mukokiliære epithelia15,17,22, der udnytter den intakte ectoderm, giver de dybe ectoderm-afledte organoider, der præsenteres i denne protokol, en klar mulighed for at overvåge vævsmekanikdrevne regenereringsfaser af overfladeepitel14. På omkring 2 hpa, den nyligt genererede ZO-1 positive epitelceller (Figur 2) begynder at dukke op på den apikale overflade af organoids og øge deres befolkning til at dække hele organoid som væv størkne eller reducerer overholdelse14. Regenereringen af epitel og efterfølgende afstamningsspecifikationer for slimproducerende bægerceller sker spontant i et kemisk defineret kulturmedie inden for en dag. Disse hastigt udvikle mucociliary epitelorganoider giver en platform til at undersøge dynamisk celle adfærd i realtid, i høj opløsning, under progressive trin i epitel regenerering. De gør det også muligt at undersøge grundlæggendespørgsmål,der opstår under mucociliary epitel udvikling, homøostase, og tilknyttedesygdomme 2,9,23. Især kan den mekaniske følsomhed af de dybe progenitorceller under overgangen til epitelceller, der er identificeret i organoiderne14, tjene til at forbinde luftvejssygdomme forbundet med unormal basaldifferentiering, hvor slim-udskillende bægerceller er over- eller underproducerede23.
Mens denne protokol tilbyder en enkel tilgang til at generere disse organoids, der er flere kritiske trin for succes i eksperimenter. For at forhindre kontaminering af overfladiske epitelceller under isolering af dybe ectoderm celler fra dyrehætten, bør man overvåge dyrehætten placeret i calcium- og magnesiumfri DFA under et stereoscope og opdage det rigtige tidspunkt til at indlede adskillelsen af det mørkpigpigede overfladiske lag af dyrehætten. Hvis vævet holdes i calcium- og magnesiumfri DFA for længe, vil hele vævet adskille sig, og det vil være umuligt for dybe ectoderm-aggregater at skelne mellem dybe og overfladiske celler. For at bekræfte fraværet af overfladiske celler i dybe ectoderm aggregater anbefaler vi fluorescerende mærkning af embryoets apikale overflade med NHS-rhodamin (trin1.4 14)før mikrokirurgi; dette vil gøre det let at identificere overfladeceller, hvis de findes i de resulterende organoider. Da epitelregenerering reguleres afvævsmekanik 14, er det vigtigt at undgå utilsigtet kraftgenerering til selvorganiserende organoider. Vi foreslår især, at man undgår kontakt med glasbunden i billeddannelseskammeret under levende billeddannelse ved at placere aggregater i kanterne af TEM-gitrene, da dette giver mulighed for fri kontakt med billedvinduet af live aggregater (trin 5.1.2.). Denne in vitro–kultiverede, selvorganiseret 3D-model for mucociliary epitel vil tjene som et tractable værktøj til at besvare de grundlæggende spørgsmål, der opstår under regenerering af epitel og afstamning specifikation af bæger celler.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer af Kim lab og Lance Davidson for deres kommentarer og støtte. Dette arbejde blev støttet af Young Scientist Fellowship til HYK fra Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |