단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

요약

적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.

초록

iPSC 유래 심근세포의 성숙은 재생 치료, 약물 검사 및 질병 모델링에 있는 그들의 신청에 대한 중요한 문제점입니다. 다중 분화 프로토콜의 발달에도 불구하고 성인과 같은 표현형을 닮은 iPSC 심근세포의 생성은 여전히 도전적입니다. 심근 세포 성숙의 한 가지 주요 측면은 높은 수축 용량을 보장하기 위해 잘 조직 된 sarcomere 네트워크의 형성을 포함한다. 여기에서는 심근세포에서 α 액티닌 네트워크의 반정량 분석을 위한 슈퍼 분해능 기반 접근 방식을 제시합니다. 광활성화 국소화 현미경을 사용하여 신생아 조직으로부터 분리된 iPSC 유래 심근세포 및 심장 세포의 사코프레 길이 및 z-디스크 두께의 비교가 수행되었다. 동시에 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 적절한 이미징 조건의 중요성을 입증합니다. 우리의 결과는 이 방법이 높은 공간 해상도로 심장 세포의 구조적 성숙도를 정량적으로 모니터링하는 데 적합하다는 것을 보여 주어 sarcomere 조직의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.

서론

심근 경색 또는 심근병증과 같은 심혈관 질환(CVD)은 서구 세계^1에서주요 사망 원인으로 남아 있다. 인간의 심장은 가난한 재생 능력을 가지고 있기 때문에, CVD에서 회복을 촉진하기위한 전략에 대한 필요가있다. 여기에는 분실된 심근세포(CM)를 보충하기 위한 세포 대체 요법뿐만 아니라 효율적이고 안전한 제약 개입을 위한 새로운 부정맥 약물의 개발이 포함됩니다. 유도만능 줄기세포(iPSC)는 생체외에서 인간 CM의 무제한 생성을 위한 유망한 세포공급원으로 나타났으며, 재생 요법, 질병 모델링, 약물 스크리닝 어세서^2,,3,,4의개발에 적합하게 된다.

많은 다른 심장 분화 프로토콜이 존재하지만, iPSC 유래 CM은 여전히 시험관 내 및 생체 내 응용 프로그램^5,,6을방해하는 특정 표현성 및 기능적 측면이 부족하다. 전기 생리학, 대사 및 분자 변화 외에도 심장 성숙 과정은 힘 생성 및 세포^수축7에

프로토콜

신생아와 성인 마우스를 관련시키는 이 프로토콜에 있는 모든 단계는 로스톡 대학 의료 센터의 동물 배려를 위한 윤리적인 지침에 따라 수행되었습니다.

1. iPSC 유래 심근세포의 재배 및 해리

1. ^이전에설명된 바와 같이 2D 단층 방법을 사용하여 25일 동안 hiPSC-CM을 차별화한다.
2. 37°C에 미리 떼어내며 중온에서 실온을 지원합니다.
3. PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다.
4. 세포에 미리 예온된 해리 배지를 추가하고 37°C및 5% CO_2에서12분 동안 배양한다.
5. 셀에 지지 매체를 추가합니다.
   참고: 추가된 지지 매체의 부피는 1.4단계에서 사용되는 해리 매체의 두 배여야 합니다.
6. 5mL 세로지학적 파이펫을 사용하여 세포를 빼내게 한다.
7. 원심분리기 세포는 200 x g에서 5분 동안 및 hiPSC-CM 배양 배지^17의3mL에서 펠릿을 재연한다.
8. 종자 세포 8 잘 유리 바닥 챔버의 세포 밀도에서 75,000 세포 /잘 및 배양 3 일 동안.

결과

CM의 구조적 성숙 정도를 추정하기 위해 신생아, 완전 성숙한 성인 및 iPSC CM은 처음에 α 액틴 항체로 CM을 표시하여 사코메르 네트워크를 시각화했다. PALM 수집 후 이미지를 재구성하고 개별 필라멘트의 폭을 자동으로 감지하기 위해 플러그인 기반 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 z 디스크 두께를 측정했습니다. Sarcomere 길이는 인접한 필라멘트에 해당하는 두 개의 인접한 강도 피크 사이의 거리를 측정하여 계산되었습니다. 도 1은 iPSC 유래 CM에서 사컴레 조직의 평가를 나타낸다.

도 2A에제시된 바와 같이, iPSC-CM 및 신생아 세포는 불규칙하고 분리된 사코레 구조를 가진 유사한 α-액티닌 패턴을 나타내는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 정량적 평가는 α 액티닌 필라멘트의 길이와 두께가 거의 동일하다는 것을 보여주었으며 이는 iPSC CM의 조기 발달 .......

토론

시험관 내 기능성 iPSC 유래 CM의 생성은 재생 치료, 질병 모델링 및 약물 선별 플랫폼의 개발에 중요합니다. 그러나, 이러한 CM의 불충분 한 성숙은 심장 혈관 연구에서 주요^{장애물이다 20.} 이와 관련하여 iPSC 유래 CM의 구조적 성숙 상태를 모니터링할 수 있는 고해상도 이미징 기술이 필요합니다. 동시에, 슈퍼 분해능 현미경 검사는 최근 티틴 및^,트로포닌(10,^10,21,22)에대해 입증된 바와 같이 적절한 사커메르 형성에 필요한 특정 단백질의 기능을 정확하게 분석하는 귀중한 도구가 될 수 있다.

현재 프로토콜에서는 α 액틴 사코메르 네트워크를 분석하여 iPSC CM의 구조적 성숙도를 정량적으로 평가하는 PALM 기반 접근법을 제시합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
human iPSC cell line	Takara	Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	ibidi	80827
0.5ml eppendorf tube	Eppendorf	30121023
소 혈청 알부민	Sigma Aldrich	A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit	Stem Cell Technologies	05025
Catalase	시그마 알드리치	C40-1G
사이클로옥타테트라ene	시그마 알드리치	138924-1G
시스테아민	시그마 알드리치	30070-10g
Ca2+ 및 Mg2+가 없는 둘베코의 인산염 완충 식염수	Thermo Fisher	14190169
F(ab')2-Goat 안티 마우스 IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
피지 이미지 처리 소프트웨어(이미지 J)
Glucose	Carl Roth	X997.2
염산	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 시스템	Zeiss
파라포름알데히드	Merck	8187150100
Pyranose oxidase	Sigma Aldrich	P4234-250UN
sarcomeric α-actinin 항체 [EA-53]	Abcam	ab9465
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653
sterile water	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689