यह प्रोटोकॉल फाइब्रोटिक स्ट्रोमल डिब्बे के साथ एक 3डी बायोमिमेटिक मॉडल प्रस्तुत करता है। स्ट्रोमल एक्सपेरिलिएलर मैट्रिक्स, सेलुलर इंटरैक्शन, ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस के एक सक्रिय मध्यस्थ के जैव-भौतिक गुणों की नकल करने वाले अनुपात में शारीरिक रूप से प्रासंगिक हाइड्रोगेल के साथ तैयार किया गया।
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) क्रोनिक लिवर डिजीज के चलते एक प्राइमरी लिवर ट्यूमर विकसित होता है। क्रोनिक लिवर रोग और सूजन एक फाइब्रोटिक वातावरण की ओर जाता है जो सक्रिय रूप से हेजटोकेसिनोजेनेसिस का समर्थन और ड्राइविंग करता है। ट्यूमर स्ट्रोमा सूक्ष्म पर्यावरण और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच परस्पर क्रिया के संदर्भ में हेपेटोकारसिनोजेनेसिस में अंतर्दृष्टि इस प्रकार काफी महत्व की है। त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृति मॉडल वर्तमान इन विट्रो 2डी सेल कल्चर मॉडल और वीवो पशु मॉडलों के बीच लापता लिंक के रूप में प्रस्तावित हैं। हमारा उद्देश्य फाइब्रोटिक स्ट्रोमल कंपार्टमेंट और वैक्यूलेचर के साथ एक उपन्यास 3डी बायोमिमेटिक एचसीसी मॉडल डिजाइन करना था। ट्यूमर ईसीएम के जैव-भौतिक गुणों की नकल करने के लिए कोलेजन और फाइब्रिनोजेन जैसे शारीरिक रूप से प्रासंगिक हाइड्रोगेल को शामिल किया गया था। इस मॉडल में एक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में एम्बेडेड LX2 और HepG2 कोशिकाओं को उल्टे ट्रांसमेम्ब्रान डालने पर वरीयता प्राप्त किया गया था। HUVEC कोशिकाओं को तब झिल्ली के विपरीत दिशा में वरीयता दी गई थी। कोशिकाओं के साथ एम्बेडेड ईसीएम-हाइड्रोगेल से मिलकर तीन फॉर्मूलेशन तैयार किए गए थे और बायो-फिजिकल गुणों का निर्धारण रीलॉजी द्वारा किया गया था। सेल व्यवहार्यता 21 दिनों में एक सेल व्यवहार्यता परख द्वारा निर्धारित किया गया था । कीमोथैरेप्टिक दवा डॉक्सोरुबिसिन के प्रभाव का मूल्यांकन 2डी सह-संस्कृति और हमारे 3 डी मॉडल दोनों में 72h की अवधि के लिए किया गया था। रियोलॉजी के परिणाम बताते हैं कि फाइब्रोटिक, सिरोटिक और एचसीसी लिवर के जैव-भौतिक गुणों की सफलतापूर्वक नकल की जा सकती है। कुल मिलाकर, परिणाम इंगित करते हैं कि यह 3D मॉडल पारंपरिक 2D संस्कृतियों की तुलना में वीवो स्थिति में अधिक प्रतिनिधि है। हमारे 3 डी ट्यूमर मॉडल कीमोथेरेपी के लिए एक कम प्रतिक्रिया दिखाया, दवा प्रतिरोध आम तौर पर एचसीसी रोगियों में देखा नकल उतार ।
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) में सभी प्राथमिक यकृत कैंसर का 90% शामिल है1,2। सालाना 810,000 मौतों और 854,000 नए मामलों की रिपोर्ट के साथ यह वर्तमान में दुनिया भर में पांचवें सबसे आम कैंसर के रूप में स्थान पर है, जिसमें मृत्यु दर1की सबसे अधिक घटनाओं में से एक है। एचसीसी के विकास के लिए मुख्य रूप से पुरानी जिगर की बीमारियों से जुड़ी सूजन के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जैसे वायरल हेपेटाइटिस, क्रोनिक अत्यधिक अल्कोहल का सेवन, मेटाबोलिक सिंड्रोम, मोटापा और मधुमेह1,3,4। इन रोगों से जुड़ी सूजन के परिणामस्वरूप हेपेटोसिटे चोट और विभिन्न साइटोकिन्स का स्राव होता है जो फाइब्रोसिस5शुरू करने के लिए हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं और भड़काऊ कोशिकाओं को सक्रिय और भर्ती करते हैं। हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं को हेपेटिक फाइब्रोसिस की दीक्षा, प्रगति और प्रतिगमन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए जाना जाता है। सक्रियण पर वे मिओफिबोब्रोब्लास्ट जैसे संकुचन, समर्थक भड़काऊ और प्रो-फिब्रिनोजेनिक गुणों के साथ कोशिकाओं की तरह अंतर करते हैं6,7,8। परिणामस्वरूप फाइब्रोसिस के परिणामस्वरूप एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स रिमॉडलिंग एंजाइम गतिविधि के डिस्रेलेशन का कारण बनता है, जिससे विकास कारकों के स्राव के साथ समग्र वृद्धि की कठोरता की विशेषता वाला वातावरण बनता है, जो एचसीसी रोगजनन9,10में आगे योगदान देता है। यह हेपेटोसाइट्स और स्ट्रोमल वातावरण के बीच यह निरंतर रोगजनक प्रतिक्रिया लूप है, जो कैंसर दीक्षा को ईंधन देता है, मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी), एंजियोजेनेसिस, मेटास्टैटिक क्षमता और परिवर्तित दवा प्रतिक्रिया11,12,13के लिए एपिथेलियल। ट्यूमर और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण के बीच परस्पर क्रिया के संदर्भ में हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस में अंतर्दृष्टि, इसलिए, न केवल एक मशीनी से बल्कि उपचार के नजरिए से भी काफी महत्व की है।
दो आयामी (2डी) इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल मुख्य रूप से कैंसर सेल जीवविज्ञानियों के 80% द्वारा उपयोग किए जाते हैं14। हालांकि, ये मॉडल सच्चे ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण के प्रतिनिधि नहीं हैं, जो कीमोथैरेपी प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है14,15,16। वर्तमान में 96% कीमोथैरेप्टिक दवाएं नैदानिक परीक्षणों के दौरान विफल हो जाती हैं14. दवा उदासीनता दरों में इस उच्च घटना को इस तथ्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि इन विट्रो प्री-स्क्रीनिंग मॉडल पूरी तरह से एचसीसी जटिलता और माइक्रोएनवायरमेंट16की हमारी वर्तमान अंतर्दृष्टि और समझ का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। इसके विपरीत वीवो पशु मॉडल में16,17मनुष्यों की तुलना में ट्यूमर और माइक्रोएनवायरमेंट के बीच बातचीत में समझौता प्रतिरक्षा प्रणाली और विसंगतियों के साथ मौजूद हैं । पशु अध्ययन से प्राप्त औसतन केवल 8% परिणामों का पूर्व-नैदानिक से नैदानिक सेटिंग16,17तक मज़बूती से अनुवाद किया जा सकता है। इसलिए, यह स्पष्ट है कि एचसीसी के मूल्यांकन के लिए एक इन विट्रो मंच के विकास की आवश्यकता होती है जो न केवल ट्यूमर बल्कि माइक्रोएनवायरमेंट की जटिलता को प्रभावी ढंग से पुनः कृत करता है। यह प्लेटफॉर्म वर्तमान में विट्रो प्री-क्लीनिकल स्क्रीनिंग मॉडल में उपलब्ध पूरक होंगे और भविष्य में7,14में पशु अध्ययन की मात्रा को कम करेंगे।
ऐसा ही एक मंच उन्नत त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृति मॉडल है। एचसीसी का अध्ययन करने के लिए इन उन्नत 3 डी मॉडलों की एक भीड़ पिछले दशक में उभरी है और विभिन्न समीक्षाएं प्रकाशित की गई हैं। एचसीसी का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध 3 डी मॉडल में बहुकोशिकीय स्फेरॉइड, ऑर्गेनॉइड, पाड़ आधारित मॉडल, हाइड्रोगेल, माइक्रोफ्लुइडिक्स और बायो-प्रिंटिंग शामिल हैं। इनमें से, बहुकोशिकीय स्फेरॉइड ट्यूमर विकास के अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सबसे प्रसिद्ध मॉडलों में से एक हैं। स्पेरोइड एक सस्ता मॉडल है जिसमें तकनीकी कठिनाई कम होती है , जबकि साथ ही वीवो ट्यूमर आर्किटेक्चर 18,19,20में प्रभावीरूपसे नकल करते हैं । बहुकोशिकीय स्फेरॉइड ने एचसीसी17 , 21,22के बारे में जानकारी के धन में योगदान दियाहै। हालांकि, मानकीकृत संस्कृति समय की कमी है क्योंकि बहुकोशिकीय स्फेरॉइड को 7 से 48 दिनों के बीच संस्कृति में रखा जाता है। संस्कृति के समय में वृद्धि का काफी महत्व है । Eilenberger ने पाया कि स्फेरॉइड उम्र में अंतर सोराफेनिब (जिगर के कैंसर के इलाज के लिए उपयोग किया जाने वाला एक किनेज़ अवरोधक) को गहराई से प्रभावित करताहै। जबकि Wrzesinski और Fey ने पाया कि 3 डी हेपेटोसाइट स्पेरोइड्स को ट्राइपिनाइजेशन के बाद प्रमुख शारीरिक यकृत कार्यों को फिर से स्थापित करने के लिए 18 दिनों की आवश्यकता होती है और इस वसूली24, 25के बाद 24 दिनों तक स्थिर कार्यक्षमता का प्रदर्शन करना जारी रखता है।
कुछ अधिक उन्नत 3 डी एचसीसी मॉडल में मानव डिसेलुलराइज्ड लिवर मचान और बायो-मुद्रित मचान का उपयोग शामिल है। मज़्ज़ा और उनके सहयोगियों ने एचसीसी मॉडलिंग के लिए एक प्राकृतिक 3डी पाड़ बनाया, जिसमें डिसेलुलरीकृत मानव यकृत का उपयोग करके प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं है26. इन प्राकृतिक मचानों को सफलतापूर्वक 21 दिनों के लिए हेपेटिक स्टेलेट और हेपेटोब्लास्टोमा कोशिकाओं की सह-संस्कृति के साथ फिर से आबाद किया जा सकता है, जबकि कोलेजन टाइप I, III, IV और फाइब्रोनेक्टिन जैसे प्रमुख बाह्य मैट्रिक्स घटकों की अभिव्यक्ति को बनाए रखते हैं। रोग मॉडलिंग के अलावा, यह मॉडल कार्यात्मक अंग प्रत्यारोपण और पूर्व-नैदानिक दवा और विषाक्तता स्क्रीनिंग26का लाभ भी प्रदान करता है। 3डी बायो-प्रिंटिंग में प्रगति के साथ, 3डी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स मचान अब बायो-प्रिंटेड भी हो सकते हैं। एमए और सहयोगियों, जैव मुद्रित एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स मचान वेरिएबल मैकेनिकल गुणों और बायोमिमेटिक माइक्रोआर्किटचर के साथ डिसेलुलराइज्ड एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स27से हाइड्रोगेल्स इंजीनियर का उपयोग कर रहे हैं । निस्संदेह ये सभी उत्कृष्ट 3 डी एचसीसी मॉडल हैं। हालांकि, मानव यकृत की अनुपलब्धता और आवश्यक उपकरण और सामग्री प्राप्त करने में शामिल लागत इन मॉडलों को नुकसान में रखती है। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों सभी तकनीकी रूप से व्यापक प्रशिक्षण है कि सभी शोधकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है की आवश्यकता उन्नत कर रहे हैं ।
एचसीसी की जटिलता और वर्तमान में उपलब्ध 3डी मॉडल के आधार पर, हमने एक सर्वव्यापी 3डी एचसीसी मॉडल विकसित करने का प्रयास किया। हम समायोज्य हाइड्रोगेल कठोरता मूल्यों को शामिल करके दोनों प्रीमैचेंडेंट और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को फिर से पूंजीपूंज करने में सक्षम मॉडल के लिए लक्षित हैं। इसके अलावा, हमने हेपेटोसेलुलर और स्ट्रोमा से जुड़ी सेल लाइनें भी शामिल कीं, जो एचसीसी के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इनमें एंडोथेलियल कोशिकाएं, हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाएं और घातक हेपेटोसाइट्स शामिल हैं, जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक हाइड्रोगेल्स से बने माइक्रोएनवायरमेंट में उगाए जाते हैं। चुने हुए हाइड्रोगेल, कोलेजन प्रकार I और फाइब्रिनोजेन के साथ, एचसीसी की दीक्षा और प्रगति के दौरान जिगर की कठोरता में देखे गए जैव-शारीरिक परिवर्तनों के तुलनीय अनुपात में शामिल किया गया। इसके अतिरिक्त, हम एक मॉडल है कि संस्कृति में एक लंबे समय तक अवधि के लिए रखा जा सकता है के लिए उद्देश्य । हमने एक मॉड्यूलर, लागत प्रभावी मॉडल की कल्पना की जिसे बुनियादी उपकरणों, न्यूनतम प्रशिक्षण और अनुभव और आसानी से उपलब्ध सामग्रियों के साथ सेटअप किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल एचसीसी के लिए बायोमिमेटिक मॉडल बनाने की विधि के विकास का वर्णन करता है। एक स्पष्ट कार्यप्रवाह की स्थापना की गई है और इसमें शामिल महत्वपूर्ण कदमों की पहचान की गई है । इन महत्वपूर्ण चरणों में फिब्रिनोजेन स्टॉक समाधान की तैयारी, कोलेजन के साथ आवेषण कोटिंग और हाइड्रोगेल में शामिल कोशिकाओं को सीडिंग करना शामिल है। फाइब्रिनोजेन स्टॉक समाधान की तैयारी के दौरान उच्च सांद्रता पर छोटे वेतन वृद्धि में फाइब्रिनोजन जोड़ना महत्वपूर्ण है। इससे न केवल फाइब्रिनोजन के घुलने में लगने वाले समय में कमी आएगी बल्कि फिब्रिनोजन को लगातार और समय से पहले जेलिंग करने से भी रोका जा सकेगा जैसा कि चित्र 11में देखा गया है । फाइब्रिनोजेन जेल की तैयारी में काफी समय लगता है और यह समग्र प्रयोगात्मक सफलता को प्रभावित कर सकता है। परिणाम इंगित करता है कि एक बार फाइब्रिनोजेन जेल लगातार जेल शुरू हो जाता है तो इसे त्यागना सबसे अच्छा होता है। आवेषण को कोलेजन से लेपित किया जाना चाहिए, पीबीएस से धोया जाना चाहिए और हाइड्रोगेल में एम्बेडेड कोशिकाओं को बोने से पहले लेमिनार प्रवाह हुड के भीतर सूख जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने में विफलता कि आवेषण सूखे हैं, इसके परिणामस्वरूप हाइड्रोगेल डालने के किनारों पर फैल जाएंगे, जिसके परिणामस्वरूप एक असमान जेल होगा। जेल की असमानता अंततः परिणामों को प्रभावित करेगी जहां प्रसार एक कारक है।
चित्रा 11: फाइब्रिनोजेन/कोलेजन हाइड्रोगेल फॉर्मूलेशन के लिए फिब्रिनोजेन जेल की तैयारी। (A)फिब्रिनोजेन जेल समाधान जिसने झुरमुट बना लिए हैं और ट्यूब का पालन करने वाले अविचलित फाइब्रिनोजेन के साथ समय से पहले जेल करना शुरू कर दिया है। (ख)फिब्रिनोजेन जेल समाधान जो पूरी तरह से भंग हो गया है, समाधान स्पष्ट और थोड़ा अधिक चिपचिपा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
आवेषण पर हाइड्रोगेल सेल निलंबन को सीडिंग करते समय जितनी जल्दी हो सके काम करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि फाइब्रिनोजेन घटक थ्रोम्बिन के अलावा क्रॉसलिंक करना शुरू कर देगा। सीडिंग करते समय जेल को क्रॉसलिंकिंग से रोकने के लिए उच्च सांद्रता पर जेल निलंबन के साथ काम करते समय एक समय में छोटे काम की मात्रा तैयार करें। उत्तरार्द्ध वितरण और प्रत्येक अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त जेल की मात्रा पर प्रभाव पड़ेगा। घटकों को जोड़ने का क्रम महत्वपूर्ण है, इस प्रोटोकॉल में हमने जैल को समय से पहले क्रॉसलिंकिंग से रोकने के लिए एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह प्रदान किया। मिश्रण और मापने के दौरान एक कट पिपेट टिप के साथ काम करने वाले हाइड्रोगेल जेल निलंबन की चिपचिपाहट के कारण सलाह दी जाती है। निलंबन को मिलाते समय यह सुनिश्चित करें कि यह एक समरूप निलंबन बनाने के लिए जल्दी और समान रूप से किया जाता है। असमान मिश्रण के परिणामस्वरूप एक विषम जेल होगा जो परिणामों को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा, चित्रा 12देखें।
चित्रा 12: कोलेजन/फाइब्रिनोजेन जैल 12 अच्छी तरह से प्लेटों पर वरीयता प्राप्त । सभी जैल 2.0 x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ 20 मिलीग्राम/एमएल फिब्रिनोजेन युक्त 200 माइक्रोन की मात्रा में वरीयता प्राप्त करते हैं। (A)विषम स्थिरता के साथ हाइड्रोजेल जेल, हाइड्रोगेल का दृश्य असमान वितरण। (ख)हाइड्रोगेल्स समरूप रूप से मिश्रित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
प्रोटोकॉल अनुकूलन के बाद, मॉडल जैव भौतिक गुणों का निर्धारण करने के लिए मूल्यांकन किया गया था। रियोलॉजी डेटा से पता चला है कि शारीरिक रूप से प्रासंगिक बाह्य मैट्रिक्स घटकों अर्थात् कोलेजन टाइप I और फाइब्रिनोजेन से बना हमारा मॉडल फाइब्रोटिक, सिरोटिक और एचसीसीलिवर28, 29,30,31,32के जैव-भौतिक गुणों की नकल करने में सक्षम था। एचसीसी के लिए 3 डी मॉडल में जिगर की जकड़न का काफी महत्व है और अक्सर मॉडल विकास के दौरान अनदेखी की जाती है। बढ़ी हुई जिगर की कठोरता एचसीसी38में कीमोथैरेप्ट्यूटिक प्रतिरोध, प्रसार, प्रवासन और निद्रा से संबंधित है। जबकि एचसीसी में हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं की सक्रियता बढ़ी हुई बाह्राश मैट्रिक्स कठोरता से जुड़ी हुई है, इन हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं से जुड़े कई सिग्नलिंग रास्ते के साथ मैकेनोसेंसिटिविटी39दिखाते हैं।
एचसीसी के लिए 3डी मॉडल के विकास में हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं और एंडोथेलियल सेल जैसी स्ट्रोमा से जुड़ी कोशिकाओं को शामिल करना तेजी से प्रासंगिक हो गया है। अध्ययनों से पता चलता है कि हेपेटिक स्टेलेट और एचसीसी कोशिकाओं से बना बहुकोशिक गोलाकार गोलाकार के परिणामस्वरूप कीमोथैरेप्टिक प्रतिरोध और आक्रामक प्रवास में वृद्धि हुई, जबकि वीवो में एचसीसी ट्यूमर उपस्थिति की नकल उतारते हुए, जब एक PXT चूहों मॉडल और मानव एचसीसी ऊतक नमूनों की तुलना में17। जंग एट अल द्वारा इसी तरह के एक अध्ययन, २०१७ में हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (हुह-7) और एंडोथेलियल (HUVEC) कोशिकाओं से मिलकर बहुकोशिकीय गोलाकार पाया गया, जिसने संवहनी और आक्रामकता22को बढ़ावा दिया । इन स्फेरॉइड ने हुह-7 मोनोकल्चर स्फेरॉइड22की तुलना में डॉक्सोरुबिकिन और सोराफेनिब की काफी अधिक सांद्रता पर व्यवहार्यता दिखाई। हमारे मॉडल की व्यवहार्यता और डॉक्सोरुबिकिन के प्रति प्रतिक्रिया का मूल्यांकन, एचसीसी के अनुरूप कठोरता मूल्यों और स्ट्रोमा से जुड़ी कोशिकाओं (एलएक्स2 और एचयूवीईसी) को शामिल करने के साथ, 2 डी सह-संस्कृति मॉडल की तुलना में कीमोथेरेपी के जवाब में इसी तरह की कमी दिखाई दी। इस प्रकार, प्रभावी रूप से दवा प्रतिरोध आमतौर पर रोगियों और अन्य 3 डी एचसीसी मॉडल में देखा नकल उतार।
चूंकि यह एक मॉड्यूलर प्रणाली है, इसलिए मॉडल को अन्य बाह्य मैट्रिक्स घटकों अर्थात् लेमिनिन और हायलूरोनिक एसिड के अलावा मजबूत किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस मॉडल के भीतर उपयोग किए जाने वाले वर्तमान हाइड्रोगेल को सोडियम एल्गिनेट या चिटोसन जैसे सिंथेटिक हाइड्रोगेल द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। वर्तमान मॉडल में और संशोधन प्राथमिक सेल संस्कृतियों के साथ सेल लाइनों का प्रतिस्थापन हो सकता है ताकि और भी अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल का उत्पादन किया जा सके या अन्य ट्यूमर और स्ट्रोमल सेल लाइनों के संयोजन का उपयोग किया जा सके।
इस प्रकार हमने एचसीसी में ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ट्यूनेबल बायो-फिजिकल गुणों के साथ एक 3 डी मॉडल सफलतापूर्वक विकसित किया है। डॉक्सोरुबिसिन के जवाब में पारंपरिक 2डी संस्कृतियों की तुलना में हमने अपने मॉडल को वीवो स्थिति में अधिक प्रतिनिधि पाया है। हालांकि, अभी भी बहुत कुछ किया जाना है, हम बड़े पैमाने पर इस मॉडल की विशेषता और एक संभव मेटास्टैटिक मंच के रूप में मॉडल का पता लगाने के लिए और अधिक जटिल और दबाने सवाल है कि अध्ययन HCC में रहने का जवाब देने की उंमीद है ।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध स्वीडिश कैंसर फाउंडेशन (Cancerfonden, CAN2017/518), चिकित्सा अनुसंधान के लिए स्वीडिश सोसायटी (SSMF, S17-0092), O.E. Och Edla जोहानसंस फाउंडेशन और ओल्गा Jönssons फाउंडेशन से प्राप्त अनुदान के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था । ये फंडिंग स्रोत अध्ययन डिजाइन में शामिल नहीं थे; डेटा का संग्रह, विश्लेषण और व्याख्या; रिपोर्ट का लेखन; और प्रकाशन के लिए लेख प्रस्तुत करने के निर्णय में। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कस्टम डिज़ाइन किए गए स्पेसर्स की 3डी प्रिंटिंग यू-प्रिंट में की गई थी: U-PRINT@mcb.uu.se, मेडिसिन और फार्मेसी के अनुशासनात्मक डोमेन में उपसाला विश्वविद्यालय की 3डी-प्रिंटिंग सुविधा। हम अपनी परियोजना पर अपने मूल्यवान इनपुट के लिए पॉल ओ Callaghan शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |