Denne protokollen presenterer en 3D biomimetisk modell med tilhørende fibrotisk stromal rom. Tilberedt med fysiologisk relevante hydrogeler i forhold som etterligner de biofysiske egenskapene til den stromale ekstracellulære matrisen, en aktiv mediator for cellulære interaksjoner, tumorvekst og metastase.
Hepatocellulært karsinom (HCC) er en primær leversvulst som utvikler seg i kjølvannet av kronisk leversykdom. Kronisk leversykdom og betennelse fører til et fibrotisk miljø som aktivt støtter og driver hepatocarcinogenese. Innsikt i hepatocarcinogenese når det gjelder samspillet mellom tumors stroma mikromiljø og tumorceller er dermed av betydelig betydning. Tredimensjonale (3D) cellekulturmodeller foreslås som den manglende koblingen mellom dagens in vitro 2D-cellekulturmodeller og in vivo dyremodeller. Vårt mål var å designe en ny 3D biomimetisk HCC-modell med tilhørende fibrotisk stromalt rom og vaskulatur. Fysiologisk relevante hydrogeler som kollagen og fibrinogen ble innlemmet for å etterligne de biofysiske egenskapene til svulsten ECM. I denne modellen ble LX2- og HepG2-celler innebygd i en hydrogelmatrise seeded på den inverterte transmembraneinnsatsen. HUVEC-celler ble deretter sådd på motsatt side av membranen. Tre formuleringer bestående av ECM-hydrogeler innebygd med celler ble utarbeidet og de biofysiske egenskapene ble bestemt av revologi. Celle levedyktighet ble bestemt av en celle levedyktighet analyse over 21 dager. Effekten av det kjemoterapeutiske legemidlet doksorubicin ble evaluert i både 2D-co-kultur og vår 3D-modell i en periode på 72h. Reologi resultater viser at bio-fysiske egenskaper av en fibrotisk, cirrhotic og HCC leveren kan bli etterlignet. Samlet sett indikerer resultatene at denne 3D-modellen er mer representativ for in vivo-situasjonen sammenlignet med tradisjonelle 2D-kulturer. Vår 3D tumormodell viste en redusert respons på kjemoterapi, etterligner legemiddelresistens vanligvis sett hos HCC-pasienter.
Hepatocellulært karsinom (HCC) utgjør 90% av alle primære leverkreft1,2. Med 810.000 dødsfall og 854.000 nye tilfeller rapportert årlig er det for tiden rangert som den femte vanligste kreften over hele verden med en av de høyeste forekomstene avdødelighet 1. Utviklingen av HCC er hovedsakelig tilskrevet betennelse forbundet med kroniske leversykdommer nemlig viral hepatitt, kronisk overdreven alkoholinntak, metabolsk syndrom, fedme og diabetes1,3,4. Betennelsen forbundet med disse patologiske forholdene resulterer i hepatocyteskade og sekresjon av ulike cytokiner som aktiverer og rekrutterer lever stellateceller og inflammatoriske celler for å initiere fibrose5. Lever stellate celler er kjent for sin nøkkelrolle i initiering, progresjon, og regresjon av leverfibrose. Ved aktivering skiller de seg til myofibroblast som celler med kontraktile, proinflammatoriske og pro-fibrinogeneegenskaper 6,7,8. Den resulterende fibrose i sin tur forårsaker dysregulering av ekstracellulær matrise remodeling enzymaktivitet, og skaper et miljø preget av en generell økt stivhet ledsaget av sekresjon av vekstfaktorer, noe som ytterligere bidrar til HCC patogenese9,10. Det er denne kontinuerlige patogene tilbakemeldingssløyfen mellom hepatocytter og detstromale miljøet, som driver kreftinitiering, epitel til mesenchymale overganger (EMT), angiogenese, metastatisk potensial og endret legemiddelrespons11,12,13. Innsikt i hepatocarcinogenese når det gjelder samspillet mellom svulsten og tumormikromiljøet er derfor av betydelig betydning, ikke bare fra et mekanistisk, men også fra et behandlingsperspektiv.
Todimensjonale (2D) in vitro celle kultur modeller er hovedsakelig brukt av 80% av kreftcellebiologer14. Disse modellene er imidlertid ikke representative for det sanne tumormikromiljøet, noe som påvirker kjemoterapeutiske responser14,15,16. For tiden svikter 96% av kjemoterapeutiske legemidler under kliniske studier14. Denne høye forekomsten i legemiddelatrisjonsrater kan tilskrives det faktum at tilgjengelige in vitro pre-screening modeller ikke fullt ut representerer vår nåværende innsikt og forståelse av HCC kompleksitet og mikromiljø16. Omvendt in vivo dyremodeller tilstede med kompromittert immunforsvar og avvik i interaksjoner mellom svulsten og mikromiljøet sammenlignet med mennesker16,17. I gjennomsnitt kan bare 8% av resultatene fra dyrestudier pålitelig oversettes fra preklinisk til klinisk innstilling16,17. Derfor er det klart at evalueringen av HCC krever utvikling av en in vitro-plattform som effektivt rekafulerer kompleksiteten til ikke bare svulsten, men også mikromiljøet. Plattformene vil supplere de tilgjengelige in vitro prekliniske screeningmodellene og redusere mengden dyrestudier i fremtiden7,14.
En slik plattform er avanserte tredimensjonale (3D) cellekulturmodeller. En rekke av disse avanserte 3D-modellene for å studere HCC har dukket opp i løpet av det siste tiåret, og ulike vurderinger har blitt publisert. Tilgjengelige 3D-modeller for å studere HCC inkluderer flercellede sfæroider, organoider, stillasbaserte modeller, hydrogeler, mikrofluidiker og bio-printing. Av disse er flercellede sfæroider en av de mest kjente modellene som brukes i studien av tumorutvikling. Sfæroider er en billig modell med lav teknisk vanskelighetsgrad samtidig effektivt etterligne in vivo tumor arkitektur18,19,20. Flercellede sfæroider har bidratt til et vell av informasjon om HCC17,21,22. Imidlertid mangler standardisert kulturtid som flercellede sfæroider holdes i kultur mellom 7 og 48 dager. Økt kulturtid er av stor betydning. Eilenberger fant at forskjellene i sfæroid alder dypt påvirker Sorafenib (en kinasehemmer som brukes til behandling av leverkreft) diffusivitetog toksisitet 23. Mens Wrzesinski og Fey fant at 3D hepatocyte sfæroider krever 18 dager for å re-etablere viktige fysiologiske leverfunksjoner etter trypsinisering og fortsetter å vise stabil funksjonalitet i opptil 24 dager etter denneutvinningen 24,25.
Noen av de mer avanserte 3D HCC-modellene inkluderer bruk av menneskelige decellulariserte leverstillas og biotrykte stillas. Mazza og kolleger skapte et naturlig 3D-stillas for HCC-modellering ved hjelp av decellulariserte menneskelige lever som ikke er egnet fortransplantasjon 26. Disse naturlige stillasene kunne med hell befolkes i 21 dager med en co-kultur av hepatisk stellate og hepatoblastomceller, samtidig som uttrykket for viktige ekstracellulære matrisekomponenter som kollagen type I, III, IV og fibronectin opprettholdes. Annet enn sykdomsmodellering, tilbyr denne modellen også fordelen av funksjonell organtransplantasjon og preklinisk legemiddel- og toksisitetsscreening26. Med fremskrittene innen 3D-bioutskrift kan 3D ekstracellulære matrisestillas nå også skrives ut. Ma og kolleger, bio-trykte ekstracellulære matrise stillas med variable mekaniske egenskaper og biomimetisk mikroarkitektur ved hjelp av hydrogels ingeniør fra decellularized ekstracellulær matrise27. Utvilsomt er disse alle gode 3D HCC-modeller. Imidlertid plasserer utilgjengelighet av menneskelige lever og kostnadene involvert i å anskaffe nødvendig utstyr og materialer disse modellene på en ulempe. I tillegg er disse metodene alle teknisk avanserte som krever omfattende opplæring som kanskje ikke er lett tilgjengelig for alle forskere.
Basert på kompleksiteten til HCC og for tiden tilgjengelige 3D-modeller, forsøkte vi å utvikle en altomfattende 3D HCC-modell. Vi siktet på en modell som kunne rekasitere både premalignant og tumor mikromiljø ved å innlemme justerbare hydrogelstivhetsverdier. Videre inkluderte vi også hepatocellulære og stroma tilknyttede cellelinjer, som spiller en nøkkelrolle i patogenesen av HCC. Disse inkluderer endotelceller, lever stellateceller og ondartede hepatocytter, dyrket i et mikromiljø bestående av fysiologisk relevante hydrogeler. Med de valgte hydrogelene, kollagen type I og fibrinogen, innlemmet i forhold som kan sammenlignes med bio-fysiske endringer sett i leverstivhet under initiering og progresjon av HCC. I tillegg siktet vi på en modell som kunne holdes i kultur i en lengre tidsperiode. Vi så for oss en modulær, kostnadseffektiv modell som kan settes opp med grunnleggende utstyr, minimal trening og erfaring, og lett tilgjengelige materialer.
Denne protokollen beskriver utviklingen av en metode for å lage en biomimetisk modell for HCC. Det er opprettet en klar arbeidsflyt og de kritiske trinnene som er identifisert. Disse kritiske trinnene inkluderer, utarbeidelse av fibrinogen lagerløsningen, belegg innsatsene med kollagen og såing cellene imbedded inn i hydrogelen. Under utarbeidelsen av fibrinogen lagerløsningen er det viktig å legge til fibrinogen i mindre trinn ved høyere konsentrasjoner. Dette vil ikke bare redusere tiden det tar for fibrinogen å oppløse, men vil også hindre fibrinogen fra gelling inkonsekvent og for tidlig som sett i figur 11. Utarbeidelsen av fibrinogengelen tar en betydelig mengde tid, og dette kan påvirke den generelle eksperimentelle suksessen. Resultatene indikerer at når fibrinogengelen begynner å gele inkonsekvent, er det best å kaste den. Innsatsene skal være belagt med kollagen, vaskes med PBS og tørkes i laminærstrømningshetten før de sår cellene som er innebygd i hydrogeler. Hvis du ikke sikrer at innsatsene er tørre, vil hydrogelene søle over kantene på innsatsen, noe som resulterer i en ujevn gel. Ujevnhet i gelen vil til slutt påvirke resultater der diffusjon er en faktor.
Figur 11: Tilberedning av fibrinogengel for fibrinogen/kollagenhydrogelformuleringer. (A) Fibrinogen gel løsning som har dannet klumper og begynte å gele for tidlig med uløst fibrinogen følge røret. (B) Fibrinogen gel løsning som er oppløst helt, oppløsningen er klar og litt mer viskøs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det anbefales å jobbe så fort som mulig mens du så hydrogel celle suspensjon på innsatsene, som fibrinogen komponenten vil begynne å kryssbinde med tillegg av trombin. Forbered mindre arbeidsvolumer om gangen når du arbeider med gelsuspensjoner ved høyere konsentrasjoner for å hindre at gelen kryssbinder under såing. Sistnevnte vil ha en effekt på fordelingen og mengden gel seeded på hver brønn. Rekkefølgen på å legge til komponentene er kritisk, i denne protokollen ga vi en strømlinjeformet arbeidsflyt for å hindre geler fra å krysslinke for tidlig. På grunn av viskositeten til hydrogelgelfjæringen anbefales det å arbeide med en kuttpipettespiss under blanding og måling. Ved blanding av suspensjonen må du sørge for at dette gjøres raskt og jevnt for å skape en homogen suspensjon. Ujevn blanding vil resultere i en heterogen gel som vil påvirke resultatene negativt, se figur 12.
Figur 12: Kollagen/fibrinogengeler seeded på 12 brønnplater. Alle geler seeded med et volum på 200 μL som inneholder 2mg / ml kollagen og 20 mg / ml Fibrinogen med 2,0 x 106 celler / ml. (A)Hydrogelgel med heterogen konsistens, synlig ujevn fordeling av hydrogelene. (B)Hydrogels homogent blandet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter protokolloptimaliseringen ble modellen evaluert for å bestemme modellenes biofysio fysiske egenskaper. Reologidata viste at vår modell, bestående av fysiologisk relevante ekstracellulære matrisekomponenter nemlig kollagen type I og fibrinogen, var i stand til å etterligne de biofysiske egenskapene til en fibrotisk, cirrhotic og HCC lever28,29,30,31,32. Rekapituerende leverstivhet i 3D-modeller for HCC er av betydelig betydning og blir ofte oversett under modellutvikling. Økt leverstivhet er relatert til kjemoterapeutisk resistens, spredning, migrasjon og dvalen i HCC38. Mens aktiveringen av lever stellate celler i HCC er forbundet med økt ekstracellulær matrisestivhet, med flere signalveier forbundet med disse lever stellate cellene som viser mekanosensitivitet39.
Inkluderingen av stroma tilknyttede celler som lever stellate celler og endotelcelle i utviklingen av 3D-modeller for HCC har blitt stadig mer relevant. Studier viser at flercellede sfæroider bestående av hepatisk stellate og HCC-celler resulterte i økt kjemoterapeutisk resistens og invasiv migrasjon, mens etterlignet HCC tumor utseende in vivo, sammenlignet med en PXT mus modell og menneskelige HCC vevsprøver17. En lignende studie av Jung et al., 2017 fant multicellulær sfæroid bestående av hepatocellulært karsinom (Huh-7) og endotelceller (HUVEC) celler fremmet vaskularisering og aggressivitet22. Disse sfæroidene viste levedyktighet ved signifikant høyere konsentrasjoner av doksorubicin og sorafenib sammenlignet med Huh-7 monokultur spheroider22. Evalueringen av vår modells levedyktighet og respons på doksorubicin, med stivhetsverdier som tilsvarer HCC og inkludering av stromarelaterte celler (LX2 og HUVEC), viste en lignende reduksjon som svar på kjemoterapeutiske midler sammenlignet med en 2D-kokulturmodell. Dermed, effektivt etterligne narkotikaresistens vanligvis sett hos pasienter og andre 3D HCC modeller.
Siden dette er et modulært system kan modellen befestes ved tilsetning av andre ekstracellulære matrisekomponenter nemlig laminin og hyaluronsyre. Alternativt kan de nåværende hydrogelene som brukes i denne modellen erstattes av syntetiske hydrogeler som natriumlginat eller chitosan. Ytterligere endringer i den nåværende modellen kan være substitusjon av cellelinjene med primære cellekulturer for å produsere en enda mer fysiologisk relevant modell eller ved hjelp av kombinasjoner av andre tumor- og stromale cellelinjer.
Vi har dermed utviklet en 3D-modell med justerbare biofysiske egenskaper for å studere tumor-stroma interaksjoner i HCC. Vi har funnet vår modell å være mer representativ for in vivo situasjonen sammenlignet med tradisjonelle 2D kulturer som svar på doxorubicin. Det er imidlertid fortsatt mye å gjøre, vi håper å i stor grad karakterisere denne modellen og utforske modellen som en mulig metastatisk plattform for å svare på mer komplekse og presserende spørsmål som gjenstår i studien HCC.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert gjennom tilskudd fra Kreftfonden, CAN2017/518), det svenske samfunnet for medisinsk forskning (SSMF, S17-0092), O.E. och Edla Johanssons foundation og Olga Jönssons foundation. Disse finansieringskildene var ikke involvert i studiedesignen; innsamling, analyse og tolkning av data; skriving av rapporten; og i beslutningen om å sende inn artikkelen for publisering. 3D-utskrift av spesialdesignede avstandssedler som brukes i denne protokollen ble utført ved U-PRINT: Uppsala Universitetets 3D-printing anlegg ved Disiplinærdomene for medisin og apotek, U-PRINT@mcb.uu.se. Vi vil gjerne takke Paul O’Callaghan for hans verdifulle innspill på prosjektet vårt.
AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |