Detta protokoll presenterar en 3D biomimetisk modell med medföljande fibrotic stromal fack. Förberedd med fysiologiskt relevanta hydrogeler i förhållanden som efterliknar de biofysiska egenskaperna hos den stromala extracellulära matrisen, en aktiv medlare av cellulära interaktioner, tumörtillväxt och metastasering.
Hepatocellular carcinom (HCC) är en primär lever tumör utvecklas i kölvattnet av kronisk leversjukdom. Kronisk leversjukdom och inflammation leder till en fibrotisk miljö som aktivt stöder och driver hepatocarcinogenes. Insikt i hepatocarcinogenes när det gäller samspelet mellan tumör stroma mikro-miljö och tumör celler är därför av stor betydelse. Tredimensionella (3D) cellkulturmodeller föreslås som den saknade länken mellan nuvarande in vitro 2D-cellkulturmodeller och in vivo-djurmodeller. Vårt mål var att designa en ny 3D biomimetisk HCC-modell med tillhörande fibröst stromalt fack och vaskulatur. Fysiologiskt relevanta hydrogeler såsom kollagen och fibrinogen införlivades för att efterlikna de bio-fysiska egenskaperna hos tumör ECM. I denna modell såddes LX2- och HepG2-celler inbäddade i en hydrogelmatris på den inverterade transmembraninsatsen. HUVEC celler såddes sedan på motsatt sida av membranet. Tre formuleringar bestående av ECM-hydrogeler inbäddade med celler utarbetades och de bio-fysiska egenskaperna fastställdes av reologi. Cellens livskraft bestämdes av en cell viabilitetsanalys under 21 dagar. Effekten av det kemoterapeutiska läkemedlet doxorubicin utvärderades i både 2D-samkultur och vår 3D-modell under en period av 72h. Reologi resultat visar att bio-fysiska egenskaper hos en fibrotic, cirrhotic och HCC lever kan framgångsrikt efterliknas. Sammantaget tyder resultaten på att denna 3D-modell är mer representativ för in vivo-situationen jämfört med traditionella 2D-kulturer. Vår 3D tumör modell visade ett minskat svar på kemoterapeutiska, härma läkemedelsresistens vanligtvis sett i HCC patienter.
Hepatocellulärt karcinom (HCC) omfattar 90% av alla primära levercancer1,2. Med 810 000 dödsfall och 854 000 nya fall rapporterade årligen rankas det för närvarande som den femte vanligaste cancern i världen med en av de högsta incidenserna avdödlighet 1. Utvecklingen av HCC tillskrivs främst inflammation i samband med kroniska leversjukdomar nämligen virushepatit, kroniskt överdrivet alkoholintag, metaboliskt syndrom, fetma och diabetes1,3,4. Inflammationen i samband med dessa patologiska tillstånd resulterar i hepatocytskada och utsöndring av olika cytokiner som aktiverar och rekryterar lever stellatceller och inflammatoriska celler för att initiera fibros5. Lever stellate celler är kända för sin nyckelroll i initiering, progression och regression av lever fibros. Vid aktivering skiljer de sig i myofibroblast som celler med kontraktila, proinflammatoriska och pro-fibrinogenic egenskaper6,7,8. Den resulterande fibrosen orsakar i sin tur dysregleringen av extracellulär matris ombyggnad enzymaktivitet, vilket skapar en miljö som kännetecknas av en övergripande ökad styvhet åtföljd av utsöndringen av tillväxtfaktorer, vilket ytterligare bidrar till HCC patogenes9,10. Det är denna kontinuerliga patogena återkopplingsslinga mellan hepatocyter och den stromala miljön, som driver cancerinitiering, epitelial till mesenchymala övergångar (EMT), angiogenes, metastaserad potential och förändrat läkemedelssvar11,12,13. Insikt i hepatocarcinogenes när det gäller samspelet mellan tumören och tumörmikromiljön är därför av stor betydelse inte bara ur ett mekanistiskt utan också ur ett behandlingsperspektiv.
Tvådimensionella (2D) in vitro-cellkulturmodeller används främst av 80% av cancercellsbiologerna14. Dessa modeller är dock inte representativa för den sanna tumörmikromiljön, vilket påverkar kemoterapeutiska svar14,15,16. För närvarande misslyckas 96% av kemoterapeutiska läkemedel under kliniska prövningar14. Denna höga incidens i läkemedelsmattningshastigheter kan hänföras till det faktum att tillgängliga in vitro-modeller före screening inte helt representerar vår nuvarande insikt och förståelse för HCC-komplexitet och mikromiljön16. Omvänt in vivo djurmodeller presenterar med komprometterade immunsystem och skillnader i interaktioner mellan tumören och mikromiljön jämfört med människor16,17. I genomsnitt kan endast 8% av resultaten från djurstudier översättas tillförlitligt från den prekliniska till den kliniskainställningen 16,17. Därför är det uppenbart att utvärderingen av HCC kräver utveckling av en in vitro-plattform som effektivt rekapitulerar komplexiteten hos inte bara tumören utan också mikromiljön. Plattformarna skulle komplettera de för närvarande tillgängliga prekliniska screeningmodellerna in vitro och minska mängden djurstudier iframtiden 7,14.
En sådan plattform är avancerade tredimensionella (3D) cellkulturmodeller. En mängd av dessa avancerade 3D-modeller för att studera HCC har dykt upp under det senaste decenniet och olika recensioner har publicerats. Tillgängliga 3D-modeller för att studera HCC inkluderar multicellulära sfäroider, organoider, ställningsbaserade modeller, hydrogeler, mikrofluidik och biotryck. Av dessa är multicellulära sfäroider en av de mest kända modellerna som används i studien av tumörutveckling. Sfäroider är en billig modell med låg teknisk svårighet samtidigt som de effektivt efterliknar in vivo tumörarkitektur18,19,20. Multicellulära sfäroider har bidragit till en mängd information om HCC17,21,22. Standardiserad kulturtid saknas dock eftersom multicellulära sfäroider hålls i kultur mellan 7 och 48 dagar. Ökad kulturtid är av stor betydelse. Eilenberger fann att skillnaderna i sfäroidålder i grunden påverkar Sorafenib (en kinashämmare som används för behandling av levercancer) diffusivitet ochtoxicitet 23. Medan Wrzesinski och Fey fann att 3D hepatocyt sfäroider kräver 18 dagar för att återupprätta viktiga fysiologiska leverfunktioner efter trypsinization och fortsätter att uppvisa den stabila funktionaliteten i upp till 24 dagar efter dennaåterhämtning 24,25.
Några av de mer avancerade 3D HCC-modellerna inkluderar användning av mänskliga decellulära leverställningar och biotryckta byggnadsställningar. Mazza och kollegor skapade en naturlig 3D-byggnadsställning för HCC-modellering med decellulerade mänskliga lever som inte är lämpliga för transplantation26. Dessa naturliga byggnadsställningar kunde framgångsrikt återbefolkas i 21 dagar med en samkultur av lever stellat och hepatoblastom celler, samtidigt upprätthålla uttrycket av viktiga extracellulära matris komponenter såsom kollagen typ I, III, IV och fibronectin. Förutom sjukdomsmodellering erbjuder denna modell också fördelen med funktionell organtransplantation och preklinisk läkemedels- och toxicitetsscreening26. Med framstegen inom 3D-biotryck kan 3D extracellulära matrisställningar nu också biotryckas. Ma och kollegor, biotryckta extracellulära matrisställningar med varierande mekaniska egenskaper och biomimetisk mikroarchitecture med hjälp av hydrogelingenjör från decellulär extracellulär matris27. Utan tvekan är dessa alla utmärkta 3D HCC-modeller. Men otillgängligheten av mänskliga lever och kostnaden för att förvärva nödvändig utrustning och material missgynnar dessa modeller. Dessutom är dessa metoder alla tekniskt avancerade vilket kräver omfattande utbildning som kanske inte är lätt tillgänglig för alla forskare.
Baserat på komplexiteten i HCC och för närvarande tillgängliga 3D-modeller strävade vi efter att utveckla en allomfattande 3D HCC-modell. Vi siktade på en modell som kan rekapitituera både premalignant och tumörmikromiljö genom att införliva justerbara hydrogelstyvhetsvärden. Dessutom inkluderade vi också hepatocellulära och stroma associerade cellinjer, som spelar en nyckelroll i patogenesen vid HCC. Dessa inkluderar endotelceller, lever stellatceller och maligna hepatocyter, odlade i en mikromiljö bestående av fysiologiskt relevanta hydrogeler. Med de valda hydrogelerna, kollagen typ I och fibrinogen, införlivas i förhållanden som är jämförbara med bio-fysiska förändringar sett i leverstelhet under initiering och progression av HCC. Dessutom siktade vi på en modell som kunde behållas i kulturen under en längre tidsperiod. Vi föreställde oss en modulär, kostnadseffektiv modell som kan ställas in med grundläggande utrustning, minimal träning och erfarenhet och lättillgängliga material.
Detta protokoll beskriver utvecklingen av en metod för att skapa en biomimetisk modell för HCC. Ett tydligt arbetsflöde har upprättats och de kritiska stegen har identifierats. Dessa kritiska steg inkluderar beredning av fibrinogen stamlösningen, beläggning av skären med kollagen och sådd av cellerna inbäddade i hydrogelen. Under beredningen av fibrinogenlagerlösningen är det viktigt att tillsätta fibrinogenen i mindre steg vid högre koncentrationer. Detta kommer inte bara att minska den tid det tar för fibrinogen att lösas upp utan kommer också att förhindra fibrinogen från att gelling inkonsekvent och för tidigt som ses i figur 11. Beredningen av fibrinogengelen tar en betydande tid och detta kan påverka den övergripande experimentella framgången. Resultaten indikerar att när fibrinogengelen börjar gel inkonsekvent är det bäst att kassera den. Skären ska vara belagda med kollagen, tvättas med PBS och torkas i laminär flödeshuv innan cellerna bäddas in i hydrogeler. Om du inte ser till att skären är torra kommer hydrogelerna att spilla över skärets kanter, vilket resulterar i en ojämn gel. Gelens ojämnhet kommer i slutändan att påverka resultaten där diffusion är en faktor.
Figur 11: Beredning av fibrinogengel för fibrinogen/kollagenhydrgelformuleringar. (A) Fibrinogen gellösning som har bildat klumpar och börjat gel för tidigt med olöst fibrinogen som följer röret. (B) Fibrinogen gellösning som har lösts upp helt, lösningen är klar och något mer trögflytande. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Det rekommenderas att arbeta så snabbt som möjligt medan hydrogelcellsupphängningen sås på skären, eftersom fibrinogenkomponenten börjar korsa länken med tillsats av trombin. Förbered mindre arbetsvolymer i taget när du arbetar med gelupphängningar vid högre koncentrationer för att förhindra att gelén korsar länken under sådd. Den senare kommer att ha en effekt på fördelningen och mängden gel som sås på varje brunn. Ordningen för att lägga till komponenterna är avgörande, i det här protokollet tillhandahöll vi ett strömlinjeformat arbetsflöde för att förhindra geler från att korslänka i förtid. På grund av hydrogelgelgelens viskositet rekommenderas att arbeta med en skuren pipettspets under blandning och mätning. Vid blandning av suspensionen se till att detta görs snabbt och jämnt för att skapa en homogen suspension. Ojämn blandning resulterar i en heterogen gel som kommer att påverka resultaten negativt, se figur 12.
Bild 12: Kollagen/fibrinogengeler sådda på 12 brunnsplattor. Alla geler sådda på en volym av 200 μL innehållande 2 mg/ml kollagen och 20 mg/ml fibrinogen med 2,0 x 106 celler/ml. A)Hydrogelgel med heterogen konsistens, synlig ojämn fördelning av hydrogelerna. B)Hydrogeler homogent blandade. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Efter protokolloptimeringen utvärderades modellen för att bestämma modellernas biofysiska egenskaper. Reologidata visade att vår modell, bestående av fysiologiskt relevanta extracellulära matriskomponenter nämligen kollagen typ I och fibrinogen, kunde efterlikna de biofysiska egenskaperna hos en fibrotisk, cirryttisk och HCC lever28,29,30,31,32. Recapitulating leverstelhet i 3D-modeller för HCC är av stor betydelse och förbises ofta under modellutveckling. Ökad leverstelhet är relaterad till kemoterapeutisk resistens, spridning, migration och vilande inom HCC38. Medan aktiveringen av lever stellate celler i HCC är associerad med ökad extracellulär matris styvhet, med flera signalering vägar som är associerade med dessa lever stellate celler visar mekanosensitivitet39.
Införandet av stroma associerade celler såsom lever stellate celler och endotel cell i utvecklingen av 3D modeller för HCC har blivit alltmer relevant. Studier visar att multicellulära sfäroider bestående av lever stellat och HCC celler resulterade i ökad kemoterapeutisk resistens och invasiv migration, samtidigt härma HCC tumör utseende in vivo, jämfört med en PXT möss modell och mänskliga HCC vävnad prover17. En liknande studie av Jung et al., 2017 fann multicellulär sfäroid bestående av hepatocellulär carcinom (Huh-7) och endotelceller (HUVEC) främjade vaskularisering och aggressivitet22. Dessa sfäroider visade livskraft vid betydligt högre koncentrationer av doxorubicin och sorafenib jämfört med Huh-7 monokultur sfäroider22. Utvärderingen av vår modells livskraft och svar på doxorubicin, med styvhetsvärden som motsvarar HCC och införandet av stroma associerade celler (LX2 och HUVEC), visade en liknande minskning som svar på kemoterapeutiska medel jämfört med en 2D co-culture modell. Således, effektivt härma läkemedelsresistens som vanligtvis ses hos patienter och andra 3D HCC-modeller.
Eftersom detta är ett modulärt system kan modellen förstärkas genom tillsats av andra extracellulära matriskomponenter nämligen laminin och hyaluronsyra. Alternativt kan de nuvarande hydrogelerna som används inom denna modell ersättas med syntetiska hydrogeler som natriumalginat eller chitosan. Ytterligare modifieringar av den nuvarande modellen kan vara att ersätta cellinjerna med primära cellkulturer för att producera en ännu mer fysiologiskt relevant modell eller använda kombinationer av andra tumör- och stromalcellslinjer.
Vi har därmed framgångsrikt utvecklat en 3D-modell med tunable bio-fysiska egenskaper för att studera tumör-stroma interaktioner i HCC. Vi har funnit vår modell vara mer representativ för in vivo-situationen jämfört med traditionella 2D-kulturer som svar på doxorubicin. Det finns dock fortfarande mycket att göra, vi hoppas kunna karakterisera denna modell i stor utsträckning och utforska modellen som en möjlig metastaserad plattform för att svara på mer komplexa och brådskande frågor som finns kvar i studien HCC.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansierades genom bidrag från Cancerfonden, CAN2017/518), Svenska föreningen för medicinsk forskning (SSMF, S17-0092), O.E. och Edla Johanssons stiftelse och Olga Jönssons stiftelse. Dessa finansieringskällor var inte involverade i studiens utformning. Insamling, analys och tolkning av uppgifter. Skrivning av rapporten. och i beslutet att lämna in artikeln för publicering. 3D-utskrift av specialdesignade distanser som används i detta protokoll utfördes på U-PRINT: Uppsala universitets 3D-printinganläggning vid Disciplinområdet medicin och farmaci, U-PRINT@mcb.uu.se. Vi vill tacka Paul O’Callaghan för hans värdefulla bidrag till vårt projekt.
AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |