ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरियल सेप्सिस का एक नवजात इमेजिंग मॉडल
Summary
बायोल्यूमिनेसेंट ई. कोलाई O1: K1: H7 के साथ नवजात चूहों का संक्रमण महत्वपूर्ण फेफड़े की सूजन और फेफड़ों की विकृति के साथ एक सेप्टिक संक्रमण में परिणाम है। यहां, हम प्रणालीगत जीवाणु बोझ, भड़काऊ प्रोफाइलिंग, और फेफड़ों के हिस्टोपैथोलॉजी की गणना के साथ समानांतर में अनुदैर्ध्य इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करके नवजात सेप्सिस को मॉडल और आगे अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं।
Abstract
नवजातों को जीवन के पहले महीनों में प्रदर्शित अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल के कारण बैक्टीरियल सेप्सिस का खतरा बढ़ जाता है। हमने ई. कोलाई O1:K1:H7 के रोगजननों का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है, जो नवजात शिशुओं में उच्च मृत्यु दर के लिए जिम्मेदार एक सेरोटाइप है। हमारी विधि संक्रमण की प्रगति के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर नवजात पिल्ले की इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करती है। यह इमेजिंग, रक्त में बैक्टीरिया की माप, भड़काऊ प्रोफाइलिंग, और ऊतक हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा समानांतर, सेप्सिस के दौरान संक्रमण गतिशीलता को समझने के लिए एक कठोर दृष्टिकोण का प्रतीक है। वर्तमान रिपोर्ट में, हम बैक्टीरियल बोझ और रोग की गंभीरता की तुलना के लिए दो संक्रामक inoculums मॉडल । हम पाते हैं कि उप-मध्य संक्रमण संक्रमण के बाद 10 घंटे तक प्रसारित संक्रमण होता है। 24 घंटे तक, ल्यूमिनेसेंट ई कोलाई का संक्रमण रक्त, फेफड़ों और अन्य परिधीय ऊतकों में प्रचुर मात्रा में था। फेफड़ों में भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति 24 घंटे में महत्वपूर्ण है, और इसके बाद सेलुलर घुसपैठ और ऊतक क्षति के सबूत होते हैं जो संक्रामक खुराक के साथ बढ़ जाता है। इंट्राविटल इमेजिंग की कुछ सीमाएं हैं। इसमें एक ल्यूमिनेसेंट सिग्नल सीमा और कुछ जटिलताएं शामिल हैं जो संज्ञाहरण के दौरान नवजात शिशुओं के साथ उत्पन्न हो सकती हैं। कुछ सीमाओं के बावजूद, हम पाते हैं कि हमारा संक्रमण मॉडल नवजात मुरीन सेप्सिस के दौरान देशांतर संक्रमण गतिशीलता को समझने के लिए एक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जिसकी आज तक अच्छी तरह से जांच नहीं की गई है। हम उम्मीद करते हैं कि इस मॉडल को प्रारंभिक जीवन के दौरान अन्य महत्वपूर्ण जीवाणु संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
बैक्टीरियल सेप्सिस उन नवजातों के लिए एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय है जो जीवन के पहले दिनों में एक अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करते हैं जो संक्रमण से पर्याप्त सुरक्षा प्रदान नहीं करता है1. नवजात सेप्सिस एक महत्वपूर्ण अमेरिकी स्वास्थ्य देखभाल समस्या अकेले अमेरिका में सालाना ७५,००० से अधिक मामलों के लिए लेखांकन जारी है2। इन संक्रमणों का गहराई से अध्ययन करने के लिए, मानव रोग के पहलुओं को फिर से बदलने वाले उपन्यास पशु मॉडल की आवश्यकता होती है। हमने ईशेरिचिया कोलाई,O1:K1:H7 3 का उपयोग करके एक नवजात माउस संक्रमण मॉडलस्थापितकिया है। ई. कोलाई अमेरिका में नवजात सेप्सिस का दूसरा प्रमुख कारण है, लेकिन सेप्सिस से जुड़े मृत्यु दर4,5केबहुमतके लिए जिम्मेदार है। हालांकि, यह प्रमुख कारण है जब पूर्व अवधि और बहुत कम जन्म-वजन (VLBW) शिशुओं को स्वतंत्र रूप से 5 मानाजाताहै। के1 सीरोटाइप सबसे अधिक बार नवजात शिशुओं में इनवेसिव ब्लडस्ट्रीम संक्रमण और दिमागी बुखार से जुड़ा होता है6,7. वर्तमान में, एंटीबायोटिक दवाओं और सहायक देखभाल से परे कोई अन्य उपचार विकल्प नहीं हैं। इस बीच, एंटीबायोटिक प्रतिरोध की दरों में कई रोगजनक बैक्टीरिया के लिए वृद्धि जारी है, ई. कोलाई के कुछ उपभेदों के साथ आमतौर पर उपचार में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं की एक भीड़ के लिए प्रतिरोधी8। इस प्रकार, यह जरूरी है कि हम सेप्सिस के तंत्र और नवजातों में मेजबान प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के तरीके उत्पन्न करना जारी रखें। इन परिणामों को वर्तमान उपचार और संक्रमण के परिणामों पर सुधार करने में मदद कर सकते हैं ।
नवजात शिशुओं की प्रतिरक्षा स्थिति वयस्कों की तुलना में फेनोटाइपिक और कार्यात्मक दोनों अंतरों की विशेषता है। उदाहरण के लिए, इंटरल्यूकिन (आईएल) -10 और आईएल-27 जैसे एंटी-भड़काऊ और नियामक साइटोकिन्स के ऊंचा स्तर को कॉर्ड रक्त-व्युत्पन्न मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित दिखाया गया है और मुरीन नवजात शिशुओं के सीरम में अधिक स्तर पर मौजूद हैं9,10,11। यह आईएफएन-α, आईएफएन-ɣ, आईएल-12 और टीएनएफ-α के निचले स्तरों के अनुरूप है जो वयस्क समकक्षों की तुलना में अक्सर नवजात कोशिकाओं से रिपोर्ट किए जाते हैं10। इसके अतिरिक्त, नवजात प्रतिरक्षा प्रणाली12वयस्कों की तुलना में एक Th2 और नियामक टी सेल प्रतिक्रिया की ओर विषम है । नवजातों में न्यूट्रोफिल, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं और मोनोसाइट्स की ऊंचा संख्या भी मौजूद है, लेकिन महत्वपूर्ण कार्यात्मक हानि के साथ। इसमें कोशिका सतह के मार्कर और एंटीजन प्रस्तुति की अभिव्यक्ति में दोष शामिल हैं जो अपरिपक्वता13,14,15को सुझाते हैं । इसके अतिरिक्त, नवजात न्यूट्रोफिल में रसायनीय कारकों में स्थानांतरित करने की उनकी क्षमता में काफी कमी होती है16. माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाएं (एमडीएससी) भी नवजातों में ऊंचा स्तर पर पाई जाती हैं और हाल ही में आईएल-2711का स्रोत दिखाया गया है। एमडीएससी टी कोशिकाओं17की ओर अत्यधिक दमनकारी हैं । सामूहिक रूप से, ये डेटा नवजात प्रतिरक्षा में सीमाओं को प्रदर्शित करता है जो संक्रमण के प्रति संवेदनशीलता को बढ़ाता है।
नवजात सेप्सिस के दौरान बैक्टीरियल बोझ की प्रगति का अध्ययन करने और सुरक्षात्मक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विच्छेदन करने के लिए, हमने एक उपन्यास संक्रमण मॉडल विकसित किया है। जीवन के 3-4 दिनों में नवजात चूहों को इंट्रापेरिटोनियल स्पेस या पूंछ नस में इंजेक्ट करना मुश्किल होता है। हमारे मॉडल में, दिन 3 या 4 पिल्ले को बैक्टीरियल इनोकुलम या पीबीएस को स्कैपुलर क्षेत्र में चमड़े के साथ प्रशासित किया जाता है। एक प्रणालीगत संक्रमण विकसित होता है और ल्यूमिनेसेंट ई. कोलाई O1: K1:H7 का उपयोग कर, हम परिधीय ऊतकों में प्रसारित जीवाणु बोझ का पालन करने के लिए व्यक्तिगत नवजात चूहों की छवि कर सकते हैं। मुरीन नवजातों में सेप्सिस केदौरानबैक्टीरिया के प्रसार के काइनेटिक्स को समझने के लिए इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करने वाला यह पहला मॉडल है ।
यहां, हम नवजात चूहों3में सेप्टिक ई. कोलाई संक्रमण को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम इंजेक्शन के लिए बैक्टीरियल इनोकुलम कैसे तैयार करें, और पैथोलॉजी के मूल्यांकन के लिए ऊतकों को कैसे फसल करें, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण द्वारा भड़काऊ मार्कर की माप, और बैक्टीरियल बोझ की गणना का वर्णन करते हैं। इसके अलावा संक्रमित नवजातों की इंट्राविटल इमेजिंग के लिए ल्यूमिनेसेंट ई कोलाई का इस्तेमाल और नवजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा बैक्टीरियल किलिंग की मात्रा का भी वर्णन किया गया है । नवजात शिशुओं में अन्य महत्वपूर्ण जीवाणु संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए इन प्रोटोकॉलों को भी अनुकूलित किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत डेटा एक अनुवाद योग्य नवजात सेप्सिस मॉडल में संक्रमण की गतिशीलता को समझने के लिए एक समग्र उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
नवजात चूहों में बैक्टीरियल सेप्सिस को प्रेरित करने के लिए हमारा उप-capular संक्रमण मॉडल वास्तविक समय में जीवाणु रोगजनकों के देशांतर प्रसार का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास विधि है। इंट्राविटल इमेजिंग नव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को संस्थागत निधियों द्वारा सी.M आर को समर्थन दिया गया था ।
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
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