Isolamento funzionale di unità motorie singole del muscolo gastrocnomio mediale del ratto
Summary
Questo metodo consente la registrazione della forza di contrazioni e contrazioni tetaniche e potenziali d’azione in tre tipi di unità motorie nel muscolo gastrocnemio mediale del ratto. L’isolamento funzionale di una singola unità motoria è indotto dalla stimolazione elettrica dell’assone.
Abstract
Questo lavoro delinea l’isolamento funzionale delle unità motorie (MU), un metodo elettrofisiologico standard per determinare le caratteristiche delle unità motorie nei muscoli posteriori (come il gastrocnemio mediale, il soleo o il muscolo plantaris) nei ratti sperimentali. Un elemento cruciale del metodo è l’applicazione di stimoli elettrici consegnati a un assone motore isolato dalla radice ventrale. Gli stimoli possono essere forniti a intervalli inter-impulso costanti o variabili. Questo metodo è adatto per esperimenti su animali in varie fasi della maturità (giovani, adulti o anziani). Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato in esperimenti che studiano la variabilità e la plasticità delle unità motorie evocate da un ampio spettro di interventi. I risultati di questi esperimenti possono aumentare le conoscenze di base nella fisiologia muscolare ed essere tradotti in applicazioni pratiche. Questa procedura si concentra sulla preparazione chirurgica per la registrazione e la stimolazione delle MU, con particolare attenzione ai passaggi necessari per raggiungere la stabilità della preparazione e la riproducibilità dei risultati.
Introduction
Le unità motorie (MU) sono le più piccole unità funzionali di muscoli scheletrici. Pertanto, comprendere la loro funzione, plasticità e proprietà contrattili, così come i meccanismi della loro regolazione della forza, è fondamentale per il progresso nella fisiologia muscolare. Le proprietà contrattuali di base delle MU e le proporzioni dei loro tipi fisiologici sono state documentate per numerosi muscoli, prevalentemente i muscoli posteriori negli animali da esperimento. Tuttavia, sia la plasticità delle proprietà MU che i meccanismi di regolazione della forza MU non sono ancora pienamente compresi.
Il principio del metodo descritto è un’ampia denervazione dei muscoli dell’arto posteriore ad eccezione di quello studiato e la laminectomia alle vertebre lombari al fine di preparare sottili radichette ventrali, ognuna contenente un singolo assone motore “funzionale”, stimolato elettricamente a registrare la forza e il potenziale d’azione del MU. Usando la tecnica descritta in questo articolo, è possibile isolare più della metà delle MU del muscolo gastrocnomio mediale in un esperimento riuscito. Il gastrocnemio mediale del ratto è composto in media da 52 MUs (femmine) o 57 MUs (maschi) di tre tipi fisiologici: S (lento), FR (resistente veloce) e FF (veloce a favore)1,2e hanno proprietà contrattili variabili3. Per gli esperimenti che confrontano i valori medi delle MU nei gruppi di controllo e sperimentali, sono necessari l’isolamento e la registrazione di 10-30 MU per ciascuno di questi gruppi. Criticamente, le singole MU possono essere accessibili per la stimolazione per periodi di tempo superiori a un’ora. Inoltre, poiché questa tecnica consente di registrare sia la forza MU che i potenziali d’azione, questo metodo è adatto per studiare fenomeni associati alla produzione di forza, valutare l’effetto della fatica e osservare la relazione tra la forza e i potenziali d’azione.
Studi precedenti hanno confermato che le proprietà della contrattile MU sono plastiche e possono essere modulate da numerosi interventi. Esperimenti con la tecnica qui descritta sono stati eseguiti su ratto mediale gastrocnemius4 o altri muscoli posteriori delratto 5,6 cosìcome sui muscoli delgatto 7, utilizzando un metodo simile di isolamento MU singolo. Un’altra serie di esperimenti che utilizzano treni di stimoli forniti a intervalli variabili inter-impulso ha fornito osservazioni riguardanti i processi di controllo motorio, e i risultati in generale rivolgono l’attenzione alla storia della stimolazione, compresi i notevoli effetti di uno spostamento della scala di tempo di uno stesso stimolo, cruciale per la produzione diforza 8,9.
Le MU possono anche essere studiate con metodi alternativi. In primo luogo, un metodo è la stimolazione diretta dei motoneuroni. Burke ha usato la stimolazione intracellulare dei motoneuroni nel gastrocnemio mediale del gatto e nel soleo con microelettrodi di vetro utilizzati in parallelo per determinare le proprietà elettrofisiologiche di questi neuroni1,10. Altri metodi sono stati proposti per studiare le MU nei muscoli umani, che richiedono un intervento notevolmente inferiore. Per tutti questi metodi, gli elettrodi stimolanti e di registrazione vengono inseriti nel muscolo o nel nervo e la forza viene registrata dal dito o dal piede. Il primo di questi metodi è stato usato per studiare le MU nel primo muscolo interosseo dorsale. Per questo muscolo, contraendo con una bassa forza, nell’elettromiogramma registrato con l’elettrodo dell’ago inserito nel muscolo sono stati identificati i potenziali d’azione di una sola unità motoria attiva. Quindi sono stati mediati i frammenti di una forza muscolare registrati in parallelo e seguendo ogni potenziale d’azione (media innescata da spike). Questo metodo consente l’estrazione della forza di un’unità motoria dalla registrazione della forzamuscolare 11. Tuttavia, la debolezza metodologica di questa procedura è che non è stata mediata una singola forza di contrazione, ma piuttosto frammenti di contrazioni tetaniche. Le MU umane possono anche essere studiate utilizzando il secondo metodo di microstimolazione elettrica intramuscolare utilizzando un elettrodoinserito nel muscolo 12, che stimola un frammento di un albero assonale, portando all’attivazione di una singola unità motoria. Il terzo metodo è la microstimolazione con un elettrodo inserito nel nervo. Quando l’elettrodo attiva un solo assone motore nel nervo, solo un’unità motoria si contrae13. Questi ultimi metodi hanno alcune limitazioni, tra cui stabilità e qualità della registrazione, restrizioni etiche e accesso al materiale sperimentale. Questo protocollo è stato ampiamente utilizzato nei gatti negli anni ’70 e ’8014.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se eseguita correttamente da scienziati esperti, la componente chirurgica del protocollo descritto deve essere completata entro circa due ore. Si dovrebbe prestare particolare attenzione a mantenere condizioni fisiologiche stabili dell’animale durante l’intervento chirurgico, in particolare la temperatura corporea e la profondità dell’anestesia, che dovrebbero essere sistematicamente controllate valutando i riflessi pinna e di astinenza. Dopo l’intervento chirurgico, dovrebbe essere possibile mantenere condizioni di reg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del Centro nazionale di ricerca polacco 2018/31/B/NZ7/01028.
Materials
| Force transducer | custom-made | ||
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11255-20 | Dumont #55 with extra light and fine shanks |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11150-10 | Extra Fine Greafe Forceps |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11026-15 | Special cupped pattern for superior grip |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11023-10 | Slim 1×2 teeth |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11251-20 | Dumont #5 |
| Hemostats | Fine Science Tools | No. 13003-10 | Hartman |
| Isolation Unit | Grass Instruments | S1U5A | |
| Low Noise Bioamplifer | World Precision Instruments | Order code 74030 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | No. 12503-15 | With tungsten carbide jaws |
| Rongeurs | Fine Science Tools | No. 16021-14 | Friedman-Pearson |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14101-14 | Straight sharp/blunt with large finger loops |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14075-11 | Curved blunt/blunt |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14084-08 | Extra fine bonn |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 15000-00 | Straight, ideal for cutting nerves |
| Stimulator | Grass Instruments | S88 | Dual Output Square Pulse Stimulator |
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