Isolamento Funcional de Unidades Motoras Únicas do Músculo Gastrocnemius Medial de Rato
Summary
Este método permite o registro da força de contrações de contração e tetanic e potenciais de ação em três tipos de unidades motoras no músculo gastrocnemius medial de rato. O isolamento funcional de uma única unidade motora é induzido por estimulação elétrica do axônio.
Abstract
Este trabalho descreve o isolamento funcional das unidades motoras (UMs), um método eletrofisiológico padrão para determinar características das unidades motoras em músculos de escalada posterior (como o gastrocnemius medial, soleus ou músculo plantaris) em ratos experimentais. Um elemento crucial do método é a aplicação de estímulos elétricos entregues a um axônio motor isolado da raiz ventral. Os estímulos podem ser entregues em intervalos inter pulse constantes ou variáveis. Este método é adequado para experimentos em animais em diferentes estágios de maturidade (jovens, adultos ou idosos). Além disso, este protocolo pode ser utilizado em experimentos que estudam a variabilidade e plasticidade das unidades motoras evocadas por um grande espectro de intervenções. Os resultados desses experimentos podem aumentar o conhecimento básico em fisiologia muscular e ser traduzidos em aplicações práticas. Este procedimento enfoca a preparação cirúrgica para o registro e estimulação das UI, com ênfase nas etapas necessárias para alcançar a estabilidade da preparação e a reprodutibilidade dos resultados.
Introduction
As unidades motoras (MUs) são as menores unidades funcionais dos músculos esqueléticos. Portanto, compreender sua função, plasticidade e propriedades contíteis, bem como os mecanismos de sua regulação de força, é crucial para o progresso na fisiologia muscular. As propriedades contratuais básicas das UI e as proporções de seus tipos fisiológicos foram documentadas para numerosos músculos, predominantemente os músculos hindlimb em animais experimentais. No entanto, tanto a plasticidade das propriedades mu quanto os mecanismos de regulação da força mu ainda não são totalmente compreendidos.
O princípio do método descrito é a denervação extensiva dos músculos hindlimb, exceto o investigado e a laminectomia nas vértebras lombares, a fim de preparar raízes ventrais finas, cada uma contendo um único axônio motor “funcional”, estimulado eletricamente para registrar a força e o potencial de ação da MU. Usando a técnica descrita neste artigo, é possível isolar mais da metade dos MUs do músculo gastrocnemius medial em um experimento bem sucedido. O gastrocnemius medial de ratos é composto em média 52 MUs (fêmeas) ou 57 UI (machos) de três tipos fisiológicos: S (lento), FR (resistente rápido) e FF (fatigable rápido)1,2, e possuem propriedades contratuaisvariáveis 3. Para experimentos comparando valores médios para MUs nos grupos de controle e experimentais, é necessário isolamento e registro de 10-30 MUs para cada um desses grupos. Criticamente, os MUs individuais podem ser acessíveis para estimulação por períodos de tempo superiores a uma hora. Além disso, uma vez que essa técnica permite o registro tanto da força de MU quanto dos potenciais de ação, este método é adequado para estudar fenômenos associados à produção de força, avaliar o efeito da fadiga e observar a relação entre os potenciais de força e ação.
Estudos anteriores confirmaram que as propriedades contraídas pela MU são plásticas e podem ser moduladas por inúmeras intervenções. Experimentos utilizando a técnica aqui descrita foram realizados em gastrocnemius medial de rato4 ou outros músculos hindlimb do rato5,6 bem como em músculos de gato7, usando um método semelhante de isolamento único de MU. Outra série de experimentos utilizando trens de estímulos entregues em intervalos inter pulse variáveis forneceu observações sobre processos de controle motor, e os resultados em geral voltam a atenção para a história da estimulação, incluindo efeitos consideráveis de uma mudança na escala de tempo de até mesmo um estímulo, crucial para a produção de força8,9.
Os MUs também podem ser estudados usando métodos alternativos. Primeiro, um método é a estimulação direta de motoneurons. Burke usou estimulação intracelular de motoneurons em gastrocnemius medial de gato e soleus com microeletrodos de vidro usados paralelamente para determinar as propriedades eletrofisiológicas desses neurônios1,10. Outros métodos foram propostos para estudar UMs em músculos humanos, que requerem uma intervenção consideravelmente menor. Para todos esses métodos, os eletrodos estimulantes e de gravação são inseridos no músculo ou nervo, e a força é registrada a partir do dedo ou do pé. O primeiro desses métodos foi utilizado para estudar UMs no primeiro músculo interosseo dorsal. Para este músculo, contraindo com baixa força, no eletromyograma registrado com o eletrodo da agulha inserido no músculo foram identificados os potenciais de ação de apenas uma unidade motora ativa. Em seguida, os fragmentos de uma força muscular registrada em paralelo e seguindo cada potencial de ação foram mediados (média desencadeada por picos). Este método permite a extração da força de uma unidade motora a partir do registro da força muscular11. No entanto, a fraqueza metodológica deste procedimento é que nenhuma força de contração única, mas sim fragmentos de contrações tetanicas foram mediados. As UBS humanas também podem ser estudadas utilizando o segundo método de microestimulação elétrica intramuscular usando um eletrodo inserido no músculo12,o que estimula um fragmento de uma árvore axonal, levando à ativação de uma única unidade motora. O terceiro método é a microestimulação com um eletrodo inserido no nervo. Quando o eletrodo ativa apenas um axônio motor no nervo, apenas uma unidade motora contrai13. Esses últimos métodos possuem algumas limitações, incluindo estabilidade e qualidade do registro, restrições éticas e acesso ao material experimental. Este protocolo tem sido amplamente utilizado em gatos nos anos 70 e80 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se realizado corretamente por cientistas experientes, o componente cirúrgico do protocolo descrito deve ser concluído dentro de aproximadamente duas horas. Deve-se tomar cuidado especial para manter condições fisiológicas estáveis do animal durante a cirurgia, particularmente temperatura corporal e profundidade da anestesia, que deve ser sistematicamente controlada através da avaliação de reflexos de pinna e abstinência. Após a cirurgia, deve ser possível manter condições estáveis de registro por pelo meno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa polonês 2018/31/B/NZ7/01028.
Materials
| Force transducer | custom-made | ||
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11255-20 | Dumont #55 with extra light and fine shanks |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11150-10 | Extra Fine Greafe Forceps |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11026-15 | Special cupped pattern for superior grip |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11023-10 | Slim 1×2 teeth |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11251-20 | Dumont #5 |
| Hemostats | Fine Science Tools | No. 13003-10 | Hartman |
| Isolation Unit | Grass Instruments | S1U5A | |
| Low Noise Bioamplifer | World Precision Instruments | Order code 74030 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | No. 12503-15 | With tungsten carbide jaws |
| Rongeurs | Fine Science Tools | No. 16021-14 | Friedman-Pearson |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14101-14 | Straight sharp/blunt with large finger loops |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14075-11 | Curved blunt/blunt |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14084-08 | Extra fine bonn |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 15000-00 | Straight, ideal for cutting nerves |
| Stimulator | Grass Instruments | S88 | Dual Output Square Pulse Stimulator |
References
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