Funktionell Isolering av single motor enheter av Råtta Medial Gastrocnemius Muscle
Summary
Denna metod gör det möjligt att registrera kraften i rycka och stelkrampkontrakt och åtgärder potentialer i tre typer av motorenheter i råttan mediala gastrocnemius muskeln. Den funktionella isoleringen av en enda motorenhet induceras genom elektrisk stimulering av axon.
Abstract
Detta arbete skisserar funktionell isolering av motoriska enheter (MUs), en standard elektrofysiologisk metod för att bestämma egenskaper hos motorenheter i hindlimb muskler (såsom den mediala gastrocnemius, soleus, eller plantaris muskel) i experimentella råttor. En avgörande beståndsdel av metoden är applikationen av elektriska stimuli som levereras till en motorisk axon som isoleras från den ventrala roten. Stimuli kan levereras med konstanta eller variabla interpulsintervall. Denna metod är lämplig för försök på djur i olika mognadsstadium (unga, vuxna eller gamla). Dessutom kan detta protokoll användas i experiment som studerar variation och plasticitet av motorenheter framkallade av ett stort spektrum av interventioner. Resultaten av dessa experiment kan både öka grundläggande kunskaper i muskelfysiologi och översättas till praktiska tillämpningar. Denna procedur fokuserar på den kirurgiska förberedelsen för registrering och stimulering av MUs, med tonvikt på nödvändiga steg för att uppnå förberedelse stabilitet och reproducerbarhet av resultat.
Introduction
Motorenheter (MUs) är de minsta funktionella enheterna i skelettmuskulaturen. Därför är förståelse för deras funktion, plasticitet och kontraktila egenskaper, liksom mekanismerna i deras kraftreglering, avgörande för framsteg i muskelfysiologi. De grundläggande kontraktila egenskaperna hos MUs och proportionerna av deras fysiologiska typer har dokumenterats för ett flertal muskler, främst hindlimb musklerna i försöksdjur. Men både plasticitet MU egenskaper och mekanismerna i MU kraft reglering är fortfarande inte helt klarlagt.
Principen för den beskrivna metoden är omfattande denervation av hindlimb muskler utom undersökta en och laminectomy vid ländkotor för att förbereda tunna ventrala rootlets, var och en som innehåller en enda “funktionella” motor axon, stimuleras elektriskt att registrera kraft och åtgärder potential mu. Med hjälp av den teknik som beskrivs i detta papper, är det möjligt att isolera mer än hälften av MUs av den mediala gastrocnemius muskeln i ett framgångsrikt experiment. Den råtta medial gastrocnemius är sammansatt av i genomsnitt 52 MUs (honor) eller 57 MUs (hanar) av tre fysiologiska typer: S (långsam), FR (snabb resistenta) och FF (snabb nedtiga)1,2, och har variabel kontraktil egenskaper3. För experiment som jämför medelvärden för MUs i kontroll- och experimentgrupperna är isolering och registrering av 10–30 MUs för var och en av dessa grupper nödvändiga. Kritiskt, enskilda MUs kan vara tillgängliga för stimulering för tidsperioder som överstiger en timme. Eftersom denna teknik möjliggör registrering av både MU-kraft och handlingspotentialer är denna metod dessutom lämplig för att studera fenomen som är förknippade med kraftproduktion, bedöma effekten av trötthet och observera förhållandet mellan kraft- och åtgärdspotentialerna.
Tidigare studier har bekräftat att MU kontraktila egenskaper är plast och kan moduleras av många insatser. Experiment med den teknik som beskrivs här har utförts på råtta medial gastrocnemius4 eller andra hindlimb muskler avråttan 5,6 samt på kattmuskler7, med en liknande metod för enda MU isolering. En annan serie experiment med tåg av stimuli levereras med varierande inter-puls intervall som observationer om motoriska styrprocesser, och resultaten i allmänhet rikta uppmärksamheten mot historien om stimulering, inklusive betydande effekter av en förskjutning i tidsskalan för ens en stimulans, avgörande för kraft produktion8,9.
MUs kan också studeras med alternativa metoder. För det första är en metod direkt stimulering av motoneuroner. Burke används intracellulära stimulering av motoneurons i katt medial gastrocnemius och soleus med glas mikroelektroder används parallellt för att bestämma de elektrofysiologiska egenskaperna hos dessa nervceller1,10. Andra metoder har föreslagits för att studera MUs i mänskliga muskler, som kräver betydligt lägre intervention. För alla dessa metoder, den stimulerande och inspelningar elektroder sätts in i muskeln eller nerv, och kraft registreras från fingret eller från foten. Den första av dessa metoder användes för att studera MUs i den första dorsala interosseous muskeln. För denna muskel, upphandlande med en låg kraft, i elektromyogram registreras med nålen elektroden införas i muskeln åtgärder potentialer endast en aktiv motor enhet identifierades. Då fragment av en muskel kraft registreras parallellt och efter varje åtgärd potential var i genomsnitt (spike-utlöst genomsnitt). Denna metod möjliggör extraktion av kraften i en motorenhet från den muskelkraftsregistrering11. Metodologiska svagheten i detta förfarande är dock att ingen enda rycka kraft utan snarare fragment av tetanic sammandragningar var i genomsnitt. Humana MUs kan också studeras med den andra metoden för intramuskulär elektrisk mikrostimulering med hjälp av en elektrod som sätts in imuskeln 12, som stimulerar ett fragment av ett axonalträd, vilket leder till aktivering av en enda motorenhet. Den tredje metoden är mikrostimulering med en elektrod insatt i nerven. När elektroden aktiverar endast en motoraxona i nerven, kontraktera endast en motorisk enhet13. Dessa sista metoder har vissa begränsningar, bland annat stabilitet och kvalitet på inspelningen, etiska begränsningar och tillgång till det experimentella materialet. Detta protokoll har använts i stor utsträckning i katter på 70-talet och 80-talet14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om den utförs korrekt av erfarna forskare, bör den kirurgiska komponenten i det beskrivna protokollet slutföras inom cirka två timmar. Man bör vara särskilt noga med att upprätthålla stabila fysiologiska förhållanden hos djuret under operationen, särskilt kroppstemperatur och djup anestesi, som systematiskt bör kontrolleras genom bedömning av pinna och tillbakadragande reflexer. Efter operationen bör det vara möjligt att upprätthålla stabila inspelningsförhållanden i minst sex timmar.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Polska nationella forskningscentrumet bidrag 2018/31/B/NZ7/01028.
Materials
| Force transducer | custom-made | ||
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11255-20 | Dumont #55 with extra light and fine shanks |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11150-10 | Extra Fine Greafe Forceps |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11026-15 | Special cupped pattern for superior grip |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11023-10 | Slim 1×2 teeth |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11251-20 | Dumont #5 |
| Hemostats | Fine Science Tools | No. 13003-10 | Hartman |
| Isolation Unit | Grass Instruments | S1U5A | |
| Low Noise Bioamplifer | World Precision Instruments | Order code 74030 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | No. 12503-15 | With tungsten carbide jaws |
| Rongeurs | Fine Science Tools | No. 16021-14 | Friedman-Pearson |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14101-14 | Straight sharp/blunt with large finger loops |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14075-11 | Curved blunt/blunt |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14084-08 | Extra fine bonn |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 15000-00 | Straight, ideal for cutting nerves |
| Stimulator | Grass Instruments | S88 | Dual Output Square Pulse Stimulator |
References
- Burke, R. E., Levine, D. N., Tsairis, P., Zajac, F. E. Physiological types and histochemical profiles in motor units of the cat gastrocnemius. Journal of Physiology. 234, 723-748 (1973).
- Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H. The number of motor units in the medial gastrocnemius muscle of male and female rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 58, 821-828 (2007).
- Grottel, K., Celichowski, J. Division of motor units in medial gastrocnemius muscle of the rat in light of variability of their principal properties. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 50, 571-588 (1990).
- Celichowski, J., Krutki, P. Variability and plasticity of motor unit properties in mammalian skeletal muscle. Biocybernetics and Biomedical Engineering. 32 (4), 33-45 (2012).
- Gardiner, P. F., Olha, A. E. Contractile and electromyographic characteristics of rat plantaris motor unit types during fatigue in situ. Journal of Physiology. 385, 13-34 (1987).
- Drzymała-Celichowska, H., Kaczmarek, P., Krutki, P., Celichowski, J. Summation of slow motor unit forces at constant and variable interpulse intervals in rat soleus muscle. Journal of Electromyography and Kinesiology. 30, 1-8 (2016).
- Krutki, P., Celichowski, J., Łochyński, D., Pogrzebna, M., Mrówczyński, W. Interspecies differences of motor units properties in the medial gastrocnemius muscle of cat and rat. Archives Italiennes de Biologie. 144, 11-23 (2006).
- Burke, R. E., Rudomin, P., Zajac, F. E. The effect of activation history on tension production by individual muscle units. Brain Research. 109, 515-529 (1976).
- Celichowski, J. Mechanisms underlying the regulation of motor unit contraction in the skeletal muscle. Journal of Physiology and Pharmacology. 51, 17-33 (2000).
- Burke, R. E., Levine, D. N., Salcman, M., Tsairis, P. Motor units in cat soleus muscle: physiological, histochemical and morphological characteristics. Journal of Physiology. 238, 503-514 (1974).
- Milner-Brown, H. S., Stein, R. B., Yemm, R. The contractile properties of human motor units during voluntary isometric contractions. Journal of Physiology. 228, 285-306 (1973).
- Taylor, A., Stephens, J. A. Study of human motor unit contractions by controlled intramuscular microstimulation. Brain Research. 117, 331-335 (1976).
- Westling, G., Johansson, R. S., Thomas, C. K., Bigland-Ritchie, B. Measurement of contractile and electrical properties of single human thenar motor units in response to intraneural motor-axon stimulation. Journal of Neurophysiology. 64, 1331-1338 (1990).
- Burke, R. E. Motor units: anatomy, physiology and functional organization. APS Handbook of Physiology Series, Section 1, The Nervous System. 11, 345-422 (1981).
- Celichowski, J., Grottel, K. The dependence of the twitch course of medial gastrocnemius muscle of the rat and its motor units on stretching of the muscle. Archives Italiennes de Biologie. 130, 315-325 (1992).
- Celichowski, J., Grottel, K., Bichler, E. Differences in the profile of unfused tetani of fast motor units with respect to their resistance to fatigue in the rat medial gastrocnemius muscle. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 20, 681-685 (1999).
- Krutki, P., et al. Division of motor units into fast and slow on the basis of profile of 20 Hz unfused tetanus. Journal of Physiology and Pharmacology. 59, 353-363 (2008).
- Drzymała-Celichowska, H., Krutki, P., Celichowski, J. Summation of motor unit forces in the rat medial gastrocnemius muscle. Journal of Electromyography and Kinesiology. 20, 599-607 (2010).
- Kaczmarek, P., Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H., Kasiński, A. The image of motor unit architecture in the mechanomyographic signal during single motor unit contraction. In vivo and simulation study. Journal of Electromyography and Kinesiology. 19, 553-563 (2009).
- Celichowski, J., Krutki, P., Bichler, E. Axonal conduction velocity of motor units of rat’s medial gastrocnemius muscle. Journal of Physiology (Paris). 90, 75-78 (1996).
