מודל ריפוי פצעים מרין וניתוח פצעים מורפומטריים היסטולוגיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פצעים דו-צדדיים בעובי מלא בעכברים וכיצד לעקוב אחר, לקצור ולהכין את הפצעים לניתוח מורפומטרי. כלול תיאור מעמיק של אופן השימוש בסעיפים היסטולוגיים טוריים כדי להגדיר, לכמת ולזהות פגמים מורפומטריים במדויק.
Abstract
מודל הפצע ים-10-00 שימש בהרחבה כדי לחקור כל אחד מהשלבים החופפים באופן רציפה של ריפוי פצעים: דלקת, התפשטות ושיפוץ. פצעים מורין יש היסטולוגית מוגדר היטב ומיטה לזיהוי בקלות פצע שעליה שלבים שונים אלה של תהליך הריפוי הם מדידים. בתוך השדה, נפוץ להשתמש ב”אמצע” המוגדר באופן שרירותי של הפצע לניתוחים היסטולוגיים. עם זאת, פצעים הם ישות תלת מימדית ולעתים קרובות לא סימטרית היסטולוגית, התומכת בצורך בשיטה מוגדרת היטב וחזקה של כימות כדי לזהות פגמים מורפומטריים עם גודל אפקט קטן. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליך ליצירת פצעים דו-צדדיים בעובי מלא בעכברים, כמו גם הוראה מפורטת כיצד למדוד פרמטרים מורפומטריים באמצעות תוכנית עיבוד תמונה על מקטעים טוריים נבחרים. המדידות הדו-ממדיות של אורך הפצע, אורך האפידרמיס, אזור האפידרמיס, אזור הפצע משמשים בשילוב עם המרחק הידוע בין מקטעים כדי לשער את האזור האפידרמיס תלת מימד מכסה את הפצע, אזור הפצע הכולל, נפח אפידרמי ונפח הפצע. למרות ניתוח היסטולוגי מפורט זה הוא יותר זמן ומשאבים רב מאשר ניתוחים קונבנציונליים, הקשיחות שלה מגבירה את הסבירות של גילוי פנוטיפים חדשניים בתהליך ריפוי פצע מורכב מטבעו.
Introduction
ריפוי פצעים עוריים הוא תהליך ביולוגי מורכב עם שלבים חופפים באופן רצף. היא דורשת תיאום של תהליכים תאיים ומולקולריים המוסדרים באופן זמני ומרחבי על מנת לשחזר את תפקוד המחסום של האפיתל הפגוע. בשלב הראשון, דלקת, נויטרופילים מקרופאגים נודדים לתוך הפצע, מגייסים הגנות מקומיות ומערכתיות1. מעקב וחפיפה של השלב הדלקתי הוא שלב ההתפשטות. פיברובלסטים מתחילים להתרבות במהירות ולנדוד לתוך רקמת הגרגר. Keratinocytes הרחק מהקצה המוביל להתרבות לכיוון הפצע כמו keratinocytes מובדיל בקצה המוביל לנדוד כדי לאפיתל מחדש את הפצע2. לבסוף, שלב השיפוץ וההתבגרות מתחיל, שבמהלכו פיברובלסטים ברקמת הגרגר מתחילים לסנתז ולהפקיד קולגן. השיפוץ והארגון של המטריצה החדשה יכולים להימשך עד שנה אחת בעקבות פציעה3. בשל המורכבות של אירועים חופפים מעורבים שיחה צולבת בין סוגי תאים מרובים, ולמרות שנים של מחקר, רבים מהמנגנונים הסלולריים והמולקולריים הבסיסיים ריפוי הפצע להישאר מובן היטב.
מודל העכבר הוא המודל היונקים הדומיננטי לחקירת מנגנונים של ריפוי פצעים בשל קלות השימוש שלהם, עלות נמוכה יחסיתוניפולנטיות גנטית 1,4,5. למרות סוגים שונים של פצעים תוארו במודל murine, הנפוץ ביותר הוא פצע excisional (או אגרוף דו צדדי או ביופסיה אגרוף ישיר), ואחריו מודלים פצעחתך 4. מודל הפצע excisional יש יתרון מובהק על המודל החתך כפי שהוא מטבעו יוצר רקמת שליטה שלא עברה את תהליך הריפוי. רקמת ביופסיית הפונץ’ המחרוטת כחלק מהפרוטוקול הכירורגי יכולה להיות מעובדת באותו אופן כמו הרקמה הפצועה ולהשתמש בה כדי לבסס את התנאים ההמו-סטטיים לקריטריון הרצוי. רקמת בקרה excised עשוי להיות שימושי גם אם להעריך את ההשפעות של טיפול מוקדם בעור או אישור שינוי גנים מוצלח בזמן פציעה4.
ניתן להעריך פרמטרי ריפוי על ידי טכניקות רבות ושונות, כולל תכנון או היסטרולוגיה. עם זאת, planimetry יכול רק להעריך מאפיינים גלויים של הפצע, ו בשל הנוכחות של גלד, לעתים קרובות אינו תואם למדידות של ריפוי כי הם הדמיה על ידי היסטולוגיה, ובכך מה שהופך את ההיטולוגיה “תקן הזהב” שלניתוח 4. למרות ניתוח היסטולוגי להיות תקן הזהב, הוא מבוצע בדרך כלל על קבוצת משנה שרירותית שלהפצע 6,7. לדוגמה, חיתוך הפצע ב”חצי” לפני הטבעה וניתוח הפצע הוא כיום נוהג נפוץ כדי להפחית את הזמן והמשאבים שהושקעו על חומרי ניתוח נתונים וחיתוך. שיטת הניתוח המורפומטרי המתואר בפרוטוקול זה פותחה כדי להקיף את רקמת הפצע כולה, כדי לשקף במדויק את המאפיינים המורפולוגיים של הפצע, ולהגדיל את הסבירות לגילוי פגמים בריפוי פצעים עם גודל אפקט קטן. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים שיטה כירורגית ליצירת פצע murine הנפוץ ביותר, פצע כריתה בעובי מלא דו צדדי, כמו גם שיטה מפורטת וקפדנית לניתוח היסטולוגי כזה משמש לעתים נדירות בתחום.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל הפצע ים דו צדדי הוא הליך להתאמה אישית מאוד אשר יכול לשמש כדי ללמוד היבטים רבים ושונים של ריפוי הפצע. לפני תחילת פרויקט ריפוי הפצע, החוקרים צריכים לבצע ניתוח כוח כדי לקבוע את מספר הפצעים הדרושים כדי לזהות פגם בגודל אפקט מסוים. חוסר עקביות קיים בתוך הספרות על אם עכברים בודדים או פצעים צר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לכל חברי מעבדת דאנוולד שתרמו לייעול הפרוטוקול הזה לאורך השנים, וגם לג’ינה שטמן, שהתעקשותה לקדם את השימוש במקטעים סדרתיים לניתוח פצעים אפשרה את יצירתה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מ-NIH/NIAMS למרטין דנוואלד (AR067739).
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
