이 프로토콜은 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 생성하는 방법과 이후에 형태 분석을 위해 상처를 모니터링, 수확 및 준비하는 방법을 설명합니다. 여기에는 직렬 조직학적 섹션을 사용하여 형태학적 결함을 정의하고 정확하게 정량화하고 감지하는 방법에 대한 심층적인 설명이 포함되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
뮤린 절제 상처 모델은 염증, 증식 및 리모델링 : 상처 치유의 순차적으로 겹치는 각 단계를 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 뮤린 상처는 치유 과정의 이러한 다른 단계가 측정 할 수있는 조직학적으로 잘 정의되고 쉽게 인식 할 수있는 상처 침대를 가지고 있습니다. 필드 내에서 조직학적 분석을 위해 임의로 정의된 상처 "중간"을 사용하는 것이 일반적입니다. 그러나 상처는 3차원 실체이며 종종 조직학적으로 대칭적이지 않으며, 작은 효과 크기로 형태학적 결함을 검출하기 위해 잘 정의되고 견고한 정량화 방법의 필요성을 뒷받침한다. 이 프로토콜에서는 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 만드는 절차뿐만 아니라 일부 직렬 섹션에서 이미지 처리 프로그램을 사용하여 형태 매개 변수를 측정하는 방법에 대한 자세한 지침을 설명합니다. 상처 길이, 표피 길이, 표피 영역 및 상처 영역의 2차원 측정은 상처, 전체 상처 영역, 표피 부피 및 상처 부피를 포함하는 3 차원 표피 영역을 추정하기 위해 섹션 사이의 알려진 거리와 함께 사용됩니다. 이 상세한 조직학적 분석은 기존의 분석보다 시간과 자원이 더 많이 소비되지만, 그 엄격함은 본질적으로 복잡한 상처 치유 과정에서 새로운 표현형을 검출할 가능성을 증가시킵니다.
서론
피부 상처 치유는 순차적으로 겹치는 단계를 가진 복잡한 생물학적 과정입니다. 손상된 상피의 장벽 기능을 복원하기 위해 일시적이고 공간적으로 조절되는 세포 및 분자 공정의 조정이 필요합니다. 첫 번째 단계에서염증, 호중구 및 대식세포는 상처로 이동하여 국소 및 전신 방어1을동원합니다. 염증 단계를 따르고 겹치는 것은 증식 단계입니다. 섬유아세포는 급속히 확산되고 과립 조직으로 이동하기 시작합니다. 선두 가장자리에서 멀리 각질세포는 앞가장자리에서 분화된 각질 세포가 상처2를다시 상형화하기 위해 이동함에 따라 상처쪽으로 방향을 내다보며 증식한다. 마지막으로, 리모델링 및 성숙 단계가 시작되며, 그 동안 과립 조직의 섬유아세포는 콜라겐을 합성하고 퇴적시키기 시작합니다. 새 행렬의 리모델링 및 조직은 부상3다음에 최대 1년까지 지속될 수 있습니다. 때문에 다중 세포 모형 사이 교차 이야기와 관련시키는 중복한 사건의 복잡성 때문에, 그리고 수년간의 연구에도 불구하고, 상처 치유의 근본적인 세포 및 분자 기계장치의 많은 것은 제대로 이해되지 않습니다.
마우스 모델은 사용편의성, 상대적으로 저렴한 비용 및 유전적 매니풀성....
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프로토콜
모든 실험은 연방 규정에 따라 완료되었으며 아이오와 대학 정책 및 절차는 아이오와 IACUC 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 동물과 축산
- 모낭 단계가 텔로겐에있을 때 8-10 주에 원하는 마우스 라인의 성인 마우스를 사용합니다.
- 수술 당일, 마우스를 깨끗한 케이지와 개별적으로 집에 분리하여 상처 장애를 최소화합니다.
2. 수술
참고: 멸균 수술 조건을 유지하는 것은 필요하지 않습니다. 동물 들 간의 멸균을 유지 하기 위해 주의 해야 하는 동안, 펀치 생검 자체는 깨끗 한, 하지만 비 멸균 표면에 이루어집니다. 동물당 수술 기간은 10분에서 15분 사이입니다.
- 마취
- 이소플루란 기화기가 분당 1리터로 설정된 이소플루란 기화기와 함께 유도 챔버에서 1-2분 동안 동물을 마취한다. 대체 마취 옵션에 대한 토론을 참조하십시오.
- 절차를 시작하기 전에 적절한 마취를 확인합니다. 마취의 깊이는 단단한 발가락 핀치에 의해 확인 될 수있다.
- 유도 용기에서 코 콘으로 마우스를 옮기고 이소플루란 유량을 1.5%로 줄이....
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결과
도 5는 여러 외과 의사에 의해 다른 마우스 균주에서 생성되고 다른 개인에 의해 분석된 야생형 상처에 대한 형태측정 분석을 수행하여 얻은 측정 및 계산된 값의 범위를 묘사합니다. 다른 균주에서 야생 형 마우스는 우리의 연구와 문학9,10에서모두 설명 된 통계적 차이를 표시 할 수 있습니다. 이러한 대표적인 결과에 기초하여, 우리는 한 연구 내에서 단 하나의 균주에서 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 동일 개별이 특정 연구 결과 내의 모든 상처를 능력을 발휘하는 것이 좋습니다 하더라도, 0일째에 상처의 지역이 개별의 일 사이에서 통계적으로 다르지 않는 한 다중 개별은 군의관으로 행동할 수 있었습니다. 마지막으로, 이 프로토콜에 설명된 형태 분석이 광범위할 수 있기 때문에 여러 개인이 동일한 실험의 일부를 분석할 수 있지만, 두 개의 샘플분석 결과가 서로의 5% 이내인.......
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토론
양측 절제 상처 모델은 상처 치유의 많은 다른 측면을 연구하는 데 사용할 수있는 매우 사용자 정의 절차입니다. 상처 치유 프로젝트를 시작하기 전에 조사관은 특정 효과 크기의 결함을 감지하는 데 필요한 상처 수를 결정하기 위해 전력 분석을 수행해야합니다. 개별 마우스 또는 상처가 생물학적 복제로 사용되어야 하는지에 대한 문헌 내에 불일치가 존재하지만, 최근 연구에 따르면 단일 동물4에대한 두 상처 사이에 는 유의한 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 이것은 단 하나 동물에게서 상처가 서로 독립적이고 결점을 검출하는 데 필요한 마우스의 수를 감소시키는 생물학 복제로 간주될 수 있다는 것을 건의합니다. 이는 중성4에도달하기 위해 많은 수의 상처가 필요한 작은 효과 크기를 고려할 때 관련이 있습니다. 또한, 전력 계산의 결과는 동물 당 2 및 4 개의 상처가 가장 일반적인 각 동물에 수행되는 상처 수에 영향을 미칠 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 수년에 걸쳐이 프로토콜의 최적화에 기여 한 던발트 연구소의 모든 구성원과 상처 분석을위한 직렬 단면의 사용을 촉진하는 지속성 지나 샤테만에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH /NIAMS에서 마틴 던발트 (AR067739)에 대한 자금 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100% 에탄올 | |||
| 70% 에탄올 | |||
| 80% 에탄올 | |||
| 95% 에탄올 | |||
| 알코올 준비 | NOVAPLUS | V9100 | 70% 이소프로필 알코올, 멸균 |
| 수산화 | |||
| 생검 패드 | Cellpath | 22-222-012 | |
| 검은색 플라스틱 시트 | 단단하면서도 조작 가능한 것, 종이 한 장 크기 정도의 | ||
| 명시야 현미경 | 디지털 수집 기능 및 4X 대물렌즈 | ||
| 포함, 면 팁 애플리케이터 | |||
| 커버슬립, | 22 x 60 #1 | ||
| 치과용 왁스 시트 | |||
| 디지털 카메라 | 눈금자 포함 해당되는 경우 | ||
| 해부 티징 바늘 (직선) | |||
| 임베딩 몰드 | 22 x 22 x 12 | ||
| 임베딩 링 | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| 빙하 아세트산 | |||
| 이발기 | |||
| 가열 패드 | Conair | 촉촉한 건조 가열 패드 | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome Microtome | |||
| 블레이드 | |||
| 페인트 브러시 | |||
| 파라핀 유형 6 | |||
| 파라포름알데히드 | |||
| 퍼마운트 | |||
| 인산염 완충 용액(PBS) | |||
| 포비돈-요오드 | Aplicare | 82-255 | |
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참고문헌
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular....
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재인쇄 및 허가
