Hier gerapporteerd is een systeem voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen. Dit systeem stelt onderzoekers in staat om niet-gelokaliseerde trillingen op te roepen met goed gecontroleerde eigenschappen op nanoschaalverplaatsing en om calciumstromen te kwantificeren tijdens reacties van C. elegans op de trillingen.
Niet-gelokaliseerde mechanische krachten, zoals trillingen en akoestische golven, beïnvloeden een breed scala aan biologische processen van ontwikkeling tot homeostase. Dieren gaan met deze prikkels om door hun gedrag aan te passen. Het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke gedragsmodificatie vereist kwantificering van neurale activiteit tijdens het gedrag van belang. Hier rapporteren we een methode voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met niet-gelokaliseerde trillingen van specifieke frequentie, verplaatsing en duur. Deze methode maakt de productie van goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen mogelijk met behulp van een akoestische transducer en kwantificering van opgeroepen calciumresponsen bij eencellige resolutie. Als bewijs van principe wordt de calciumrespons van een enkel interneuron, AVA, tijdens de ontsnappingsreactie van C. elegans op trillingen aangetoond. Dit systeem zal het begrip van neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan gedragsreacties op mechanische stimuli vergemakkelijken.
Dieren worden vaak blootgesteld aan niet-gelokaliseerde mechanische stimuli zoals trillingen of akoestische golven 1,2. Omdat deze stimuli de homeostase, ontwikkeling en voortplanting beïnvloeden, moeten dieren hun gedrag aanpassen om ermee om te gaan 3,4,5. De neurale circuits en mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke gedragsverandering zijn echter slecht begrepen.
Mechanosensorisch gedrag in de nematode, Caenorhabditis elegans, is een eenvoudig gedragsparadigma, waarin wormen meestal gedrag veranderen van voorwaartse beweging naar een achterwaartse ontsnappingsreactie wanneer ze niet-gelokaliseerde trillingen tegenkomen6. Het neurale circuit dat aan dit gedrag ten grondslag ligt, bestaat voornamelijk uit vijf sensorische neuronen, vier paar interneuronen en verschillende soorten motorneuronen 7,8. Bovendien wennen wormen aan dergelijke mechanische stimuli na gespreide training met herhaalde stimulatie 9,10,11. Daarom vormt deze eenvoudige gedragsrespons een ideaal systeem om neurale mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan zowel niet-gelokaliseerd trillingsgevoed gedrag als geheugen. Een protocol voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende wormen onder invloed van niet-gelokaliseerde trillingen wordt geïllustreerd. In vergelijking met eerder gerapporteerde systemen is dit systeem eenvoudig omdat het geen extra camera nodig heeft voor tracking; het stelt ons echter in staat om de frequentie, verplaatsing en duur van niet-gelokaliseerde trillingen te veranderen. Omdat activering van de AVA-interneuronen de achterwaartse ontsnappingsrespons induceert, werden wormen die GCaMP, een calciumindicator, co-expressie geven, en TagRFP, een calciumongevoelig fluorescerend eiwit, onder controle van een AVA-specifieke promotor als voorbeeld gebruikt (zie Tabel met materialen voor details). Het protocol demonstreert de activering van AVA-neuronen als een worm overschakelt van voorwaartse naar achterwaartse beweging. Dit protocol vergemakkelijkt het begrijpen van het neurale circuitmechanisme dat ten grondslag ligt aan mechanosensorisch gedrag.
Over het algemeen vereist de kwantificering van neurale activiteit de introductie van een sonde en / of beperkingen op de beweging van het lichaam van dieren. Voor studies van mechanosensorisch gedrag vormen de invasieve introductie van een sonde en beperkingen zelf echter mechanische stimuli. C. elegans biedt een systeem om deze problemen te omzeilen, omdat de kenmerken ervan transparant zijn en omdat het een eenvoudig, compact neuraal circuit heeft dat slechts 302 neuronen omvat. Door deze voordelen te combine…
The authors have nothing to disclose.
We danken het Caenorhabditis Genetics Center voor het leveren van de stammen die in deze studie worden gebruikt. Deze publicatie werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grantnr. JP18H02483), over innovatieve gebieden “Science of Soft Robot” project (Grant nr. JP18H05474), de PRIME van het Japan Agency for Medical Research and Development (subsidienummer 19gm6110022h001) en de Shimadzu foundation.
Data anaylsis software | |||
DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
Escherichia coli and C. elegans strains | |||
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
Laser Doppler vibrometer | |||
Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
Mouse macro system | |||
Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
Nematode growth media plate | |||
Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
Nonlocalized vibration device | |||
Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
Noninvasive calcium imaging | |||
2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
Microscope | Olympus | MVX10 | |
sCMOS camera | Andor | Zyla | |
x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
Plasmid | |||
pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
Tracking software | |||
homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |